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1、 发 布ICS点击此处添加 ICS 号点击此处添加中国标准文献分类号RB中 华 人 民 共 和 国 认 证 认 可 行 业 标 准RB/T XXXXXXXXX转基因检测方法验证评价指南Guidance on verification of analytical methods for GMO testing（EUR 24790 EN, JRC ）（草案）XXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施中 华 人 民 共 和 国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局目 次 前 言 .3转基因检测方法验证评价指南 .41 范围 .42 规范性引用文件 .43 术语和定
2、义 .44 符号和缩略语 .55 转基因检测方法验证评价 .5附录 A （资料性附录） DNA 含量对实际 LOD 的影响 .9附录 B （资料性附录） 对 DNA 提取方法的评价（抑制试验） .11附录 C （资料性附录） 中间浓度阳性对照的生产 .14附录 D （资料性附录） 基于实时 PCR 的转基因含量平均值、标准偏差和相对可重复性标准偏差的评估 .15前 言本标准是根据 GB/T1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写中的要求进行编写的。本标准等同采用欧盟委员会联合研究中心组织编写的 EUR 24790 EN 多个实验室转基因分析方法验证的验证方法 （Verif
3、ication of analytical methods for GMO testing when implementing interlaboratory validated methods）。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：饶红、韩玥、郭铮蕾、徐姗、李伟。本标准系首次发布的认证认可行业标准。 转基因检测方法验证评价指南1范围本标准规定了转基因检测实验室方法验证评价的术语和定义、利用协同实验数据和/或实验室内部数据进行方法验证评价的程序、方法、报告与表示。本标准适用于转基因检测（如实时荧光PCR 法）方法验
4、证过程的评价、报告和表示。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 19495.1 转基因产品检测 通用要求和定义3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1方法确认 Validation of method确认是通过检查并提供客观证据，以证实某一特定预期用途的特定要求得到满足。(ISO 17025 5.4.5.1)3.2方法验证 Verification of method验证是通过提供客观证据，确认特定要求得到满足（ISO 9000:2000 3.
5、8.4）。验证一个实验室能够充分按照标准要求进行操作需要实验室提供客观证据，证明对于所用的样品基质，能满足检测方法规定的性能指标。通常，标准要求是真实度（一般用偏差形式表示）和精确度（一般为重复性和再现性），反映在测量不确定度中。客观证据是从实验室实际数据中得到的真实度和精确度。3.3可重复性标准偏差 Precision- Relative Repeatability standard deviation（RSDr）可重复性（重现性）标准偏差是指在可重复性（重现性）条件下获得的测试结果的散布的分布状态的度量标准。相同地，“可重复性（重现性）变化”或“可重复性（重现性）变化系数”可以被定义或用于
6、在可重复性（重现性）条件下获得的测试结果的散布情况的度量标准。3.4 实验室样品 Laboratory sample由原始样品经过混合、缩分得到的一定数量样品。用于制备试样和存查样品。3.5分析样品 Analytical sample实验室通过研磨制备的样品，必要时进行混匀。3.6检测部分 Test portion用于检测或分析的样品，其一次用于分析物提取的整体的量。3.7检测结果 Test result测试结果是从PCR平行得出的 Ct值或拷贝数。3.8 DNA提取平行（本文中用到的）DNA extraction replicates (as used in this document)从不
7、同分析样品的不同检测部分得到的DNA提取物3.9PCR平行( 本文中用到的) PCR replicates (as used in this document)用PCR在不同反应中对DNA提取物平行的分析3.10工作溶液 working dilution后续PCR方法中用到的DNA最高浓度。3.11定量检测低限 Limit of Quantification（LOQ）定量分析过程的低限是指被检测的样品在合适的精确度水平上能被检测出的最低含量或浓度，并且依据ISO 5727条款【2】或 【3】，经过合作实验的满意证明或单一实验室的确认。3.12实际定量检测低限 Practical limit o
8、f Quantification（practical LOQ）实际LOQ 是在已知（确定 /估计）目标种类基因拷贝数的情况下，能定量到的可信的（如95%置信水平）最低相对目标DNA的量。 3.13检测低限 Limit of Detection (LOD)定性方法的检测限是指被检测物能被可靠检出的最低浓度或含量。但是不必进行定量，并且已经经过合作实验的证明或单一实验室的确认。3.14实际检测低限 Practical limit of Detection (practical LOD)实际LOD 是在已知（确定/估计）目标种类基因拷贝数的情况下，能检测到的可信的（如95%置信水平）最低相对目标DN
9、A的量。3.15特异性 Specificity方法只对特定特性或分析物有反应的特点。3.16动态范围定量检测范围 Dynamic range - Range of quantification由合作实验室证明了分析过程内的浓度间隔具有适当水平的精确度和真实度。3.17真实度 Trueness大量实验结果的平均值和认可参考值的一致性。注：真实度（可信度）的量度标准通常是以斜率来表示的。可信度也就是所提到的“平均值的正确度”。3.18精确度 Precision在规定条件下所获得的独立测试结果之间的一致性。3.19扩增效率 Amplification efficiency每个循环达到100%效率时，
10、使理论斜率达到 -3.2的PCR扩增速度。效率（%）可用以下公式计算：效率=(10 (-1/斜率) -1) 1003.20R2系数 R2 coefficient R2是判定系数，是通过线性回归分析得到的标准曲线的相关系数（测量的Ct值和浓度对数）的平方计算出的。3.21稳健性 Robustness分析方法的稳健性是指在通常的使用情况下，检测方法不受微小、但有意的方法参数改变的影响，仍然能保持其测量可靠性的能力。4符号和缩略语下列符号和缩略语适用于本标准。Ct-value number of PCR cycles to pass a set threshold Ct值DNA deoxyribon
11、ucleic acid 脱氧核糖核酸ENGL European Network of GMO laboratories 欧洲GMO检测实验室网络EU European Union 欧盟GM genetically modified 基因改造GMO genetically modified organism 转基因生物ISO International Standards Organisation 国际标准化组织IEC International Electrotechnical Commission 国际电工委员会LOD limit of detection 检测限LOQ limit of q
12、uantification 定量检测限PCR polymerase chain reaction 聚合酶链式反应5转基因检测方法验证评价5.1DNA 提取和纯化DNA提取方法应该提供具有高质量的DNA供后续检测分析用。尽管这个标准关注的是PCR方法验证，但是DNA提取方法的评估是关键的步骤，因为DNA提取的质量对最终结果有重要影响。DNA提取方法可以是实验室间确认的方法、单个实验室确认的方法、标准方法（如ISO）和/或其它可利用的方法。步骤：对于已经确认的DNA提取方法，每次分2份至少2次（推荐3次）进行DNA 的提取，如果可能的话，不在同一天内进行，并且由不同的操作者操作。提取的DNA必须要达到一定的浓度和质量标准（如，通过控制扩增效率和用实时荧光PCR检测是否存在抑制剂，见附录B）。适用于一种基质的DNA提取方法可能不适用于其它基质。以上步骤需要针对不同基质进行。对于一个DNA提取方法
