急性白血病9号染色体微卫星复制错误的研究-2016年最新医学论文

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1、精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询急性白血病 9号染色体微卫星复制错误的研究【摘要】 目的 研究急性白血病（AL）9 号染色体微卫星复制错误（RER)现象，探讨微卫星在白血病发病过程中的作用和用于检测染色体微小缺失的意义。方法 选取 AL病人 53例，其中急性髓细胞白血病(AML)33 例，急性淋巴细胞白血病(ALL)20 例。在 9号染色体共选择 5个微卫星位点，对骨髓细胞 DNA及作为对照的自身口腔黏膜细胞 DNA进行多重 PCR扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染，观察微卫星不稳定性(MSI)和杂合性缺失(LOH)的发生情况。结果 53例 AL中，共 36例发生了至少 1

2、个位点的 MSI，AML 中有 15例发生了 MSI，10 例发生了 LOH;ALL中有 5例发生了 MSI， 4例发生了LOH。其中位于 9p21上的 D9Sl62、D9S1748、D9S171 微卫星位点LOH发生率分别为 0(0/53)、5.7%(3/53)和 7.5%(4/53), MSI发生率分别为 15.1%(8/53)、7.6%(4/53)和 11.3%(6/53)；位于 9q34上的D9S61和 D9S67位点在 AL中 LOH发生率分别为 11.3%(6/53)和5.6%(3/53)，MSI 发生率分别为 5.6%(3/53)和 9.4%(5/53)。其中D9S61位点 LO

3、H均发生于 AML，发生率为 18.1%，显著高于 ALL，差异有显著性（P=0.046） 。至少发生 2个位点 MSI即 RER+的有 6例，占 11.3%。结论 AL较高的 RER+表达率提示，广泛的 MSI与 AL的发生发展有关；AML 在 D9S61上检测出较高的 LOH提示，该区域可能存在与 AML发生有关的基因改变；微卫星标记技术为研究 AL一种新的、有价值的方法。 【关键词】 白血病 染色体 微卫星不稳定性 杂合性缺失 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询ABSTRACT Objective To study the function of microsatell

4、ite replication error (RER) in chromosome 9 during the pathogenesis of acute leukemia and to investigate the significance of MSI and LOH in detecting the minima deletions of chromosome.Methods Fiftythree cases of acute leukemia were studied, which included 33 cases of acute myeloblastic leukemia (AM

5、L) and 20 cases of acute lymphocytic leukemia (ALL). MSI and LOH in acute leukemia were detected with marrow cells at five microsatellites on chromosome 9 by multiPCR amplification, gel electrophoresis and argentine dye. Normal oral mucosa cells served as controls. Results Thirtysix cases of acute l

6、eukemia demonstrated MSI at one or more loci. In AML, 15 cases showed MSI and 10 cases showed LOH. In ALL, five cases showed MSI and four showed LOH. The frequencies of LOH was 0(0/53), 5.7 %(3/53) and 7.5%(4/53) at D9S162,D9S1748 and D9S171 on 9p21, respectively. The frequencies of MSI in the three

7、 microsatellite was 15.1%(8/53), 7.6%(4/53) and 11.3%(6/53), respectively. The frequencies of LOH at D9S61 and D9S67 is 11.3%(6/53) and 5.6%(3/53), respectively. The six cases detected LOH at D9S61 were all AML, the frequency of LOH in AML (18.1%) was 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询significantly higher t

8、han that in ALL. There were six cases (11.3%,RER+) found MSI at no less than two microsatellites.Conclusion The high frequencies of RER+ in acute leukemia indicate that the pathogenesis and progress of acute leukemia is related to the extensive MSI; AML showed significantly higher LOH frequency than

9、 ALL at D9S61, which suggests that there may be some gene alterations in AML. The microsatellite technology is a new and valuable method to investigate acute leukemia. KEY WORDS Leukemia; Chromosomes; Microsatellite instability; Loss of heterozygosity 微卫星是广泛存在于基因组中简单串联式的核苷酸重复序列，约占基因组的 5%1。微卫星标记属于高信息

10、量的遗传标志，表现为长度的多态性，高度的杂合性，自身突变率低，符合孟德尔遗传规律。因此，微卫星标记已被广泛用于遗传病连锁分析、肿瘤研究等领域。微卫星不稳定性是由于复制错误（RER）引起的简单重复序列的增加（MSI）或缺失（LOH） 。研究表明，多种恶性肿瘤可表现出MSI及 LOH。因此，对微卫星进行检测以确定染色体的细微改变，进一步寻找和定位与肿瘤发生发展相关基因成为研究肿瘤发生机制的重要方法。大量研究表明，9 号染色体短臂，特别是 9p2122 ，在许多实体肿瘤中均可检出较高的 LOH，提示 9p2122 可能存在一组抑癌基因或一个多效性基因26。9 号染色体长臂 9q34是白血病精品文档欢

11、迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询常见的染色体易位断裂点，该部位的基因改变可能与白血病的发生有关7,8。本研究在 9号染色体 9p2122 和 9q34上各选取 3个和2个微卫星位点做进一步研究，以探讨微卫星复制错误对急性白血病发病的作用，并确定是否在此区域存在候选的抑癌基因。 1 材料和方法 1.1 标本来源 1.1.1 病例组 2002年 9月2004 年 9月，共收集青岛大学医学院附属医院急性白血病病人标本 53例，其中急性髓细胞白血病(AML) 33例，急性淋巴细胞白血病(ALL)20 例。 53例病人中男 31例，女 22例；年龄 1278 岁,中位年龄 36岁。FAB 分型

12、根据血液病诊断和治疗标准9。 1.1.2 对照组 7例标本均来自青岛大学医学院附属医院门诊健康查体者，其中男 3例，女 4例，年龄 1744 岁，中位年龄 32岁。 1.1.3 良性血液病组 15例良性血液病标本均来自青岛大学医学院附属医院住院病人，包括缺铁性贫血 7例，巨幼细胞性贫血 4例，血小板减少性紫癜 4例；其中男 9例，女 6例，年龄 2064 岁，中位年龄 37岁。 1.2 方法 病例组采集新鲜骨髓涂片 23 张，或新鲜抗凝骨髓液 0.5 mL，置-20 保存备用；同时用消毒竹签刮取病人的口腔黏膜，作为自精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询身对照，放在盛有 0.5

13、mL无菌生理盐水的 EP管中，-20 保存备用。良性血液病组标本收集同病例组；健康对照组采集外周静脉血和口腔黏膜。 1.2.1 标本 DNA的提取 口腔黏膜细胞 DNA提取：收集的口腔黏膜标本低温离心后，将收集的沉淀物洗涤 2次，加入 TE消化液，置 37 水浴过夜。然后100 煮沸 10 min，低温离心后，检测提取 DNA的浓度，-20 保存备用。骨髓 DNA的提取：骨髓标本提取单个核细胞后进行单个核细胞 DNA的提取。在提取的 DNA 沉淀中加入 30 L TE贮存液，溶解 DNA后封口膜封口，-20 冻存备用。外周血 DNA的提取：取全血 0.5 mL加入 0.5 mL TE混匀，13

14、 000 r/min离心 10 min，TE 冲洗 2次，弃上清。沉淀中加入 100 L TE消化液，37 水浴过夜，100 煮沸 10 min，检测提取 DNA浓度，-20 保存备用。 1.2.2 微卫星位点的选择及引物合成 共选择 9号染色体上的 5个微卫星位点进行研究，其中D9S162、D9S171 和 D9S1748位于 9p21上， D9S61和 D9S67位于9q34上，5 个微卫星标记的杂合性均大于 70%，引物序列见表 1。由Genome Data Base（http：/www.gdb.org）查出其引物序列，由上海生工公司合成。 1.2.3 多重 PCR扩增 25 L 反应体

15、系中含有模板 DNA 0.25 ng, 4dNTP各 100 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询mol/L,引物各 10 pmol,Taqplus DNA 聚合酶 1 U, 10buffer 2.5 L(内含 Mg2+)。PCR 基本反应程序为：95 预变性 5 min；95 30 s, 55 30 s, 72 45 s，共 35个循环； 72 延伸 7 min, 4 保存。引物更换时，根据引物碱基组成和长度优化反应条件。 1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染 将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳条件为 140 V恒压100 min，然后用 2 g/L的 AgNO3染色，染

16、色后将凝胶电泳结果通过Kodak数码相机或扫描仪输入计算机进行分析。通过与自身对照电泳条带对比，观察微卫星不稳定性及杂合性缺失。 1.2.5 结果观察分析 判断样本在该卫星位点是否为有信息的:正常组织来源的标本扩增产物经电泳银染后应出现 2条等位基因条带；如果只有 1条等位基因条带，则在该位点为非信息的，无法判断其是否发生了 MSI和（或）LOH。判断样本是否有 MSI：与病人自身正常组织比较，若某一微卫星位点的等位基因条带增多、减少或位置发生改变，则记为 MSI10。判断样本是否有 LOH：与病人自身正常组织比较，若某一微卫星位点的等位基因条带消失或相对密度减少 50%以上记为 LOH11，后者可用分子生物学影像分析仪进行分析。表 1 所选微卫星引物序列位点（略） 1.2.6 统计学处理 采用四格表精确检验法。 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询2 结 果 2.1 对照组