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1、1CRD-BP RNA 表达与结直肠癌临床特征相关性分析作者：金晓菲，尹莉，陈官民，王小娟【摘要 】 ：为了解结直肠癌患者外周血中不稳定编码区结合蛋白（CRD-BP）RNA 的表达与患者临床特征的相关性， 应用荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应方法检测 32 例结直肠癌患者和 35 例对照组人群外周血中 CRD-BP RNA 的表达。结果结直肠癌组 32 个样本中有 10 个样本中检测到 CRD-BP RNA 表达，阳性表达率 31.25%，对照组 35 个样本中均未检测到 CRD-BP RNA 表达，两组间阳性表达率差异有统计学意义（P0.05） ；实验组中 CRD-BP RNA 的表达与临床分
2、期及有无淋巴结转移密切相关（P0.05） 。结直肠癌患者外周血中 CRD-BP RNA 表达可能与有无淋巴结转移、临床分期相关。 【关键词】 CRD-BP RNA；外周血；直肠癌结直肠癌在全球发病率居第三位、死亡率居第 4 位1 。近年来不稳定编码区结合蛋白（Coding Region instability Determinant-Binding Protein，CRD-BP）成为肿瘤学研究的热点。已有研究表明 CRD-BP 在结直肠癌等多种肿瘤中表达，研究其表达2与直肠癌临床特征相关性可以为临床诊断、治疗、判断结直肠癌预后提供帮助。1 材料与方法1.1 对象和分组 结直肠癌患者 32 例（
3、实验组） ，男 18 例，女 14 例，年龄3683 岁，平均 62 岁。肿瘤病理类型：根据 Dukes 分期标准进行临床分期：DukesA 期 7 例、DukesB 期 13 例、DukesC 期 10例、DukesD 期 2 例。分化程度：高分化腺癌 9 例、中分化腺癌 16例、低分化腺 7 例。术后确定肿块直径 5cm 18 例、5cm 14 例。术后确定有淋巴结转移 12 例、无淋巴结转移 20 例。所有标本均来源于宁夏医科大学附属医院，用 EDTA.Na2 抗凝管采清晨空腹静脉血 5mL。对照组共 35 例， 均选取宁夏医科大学附属医院 2006 年 1月2006 年 4 月门诊就诊
4、者，其中健康体检者 20 例，经肠镜活检确诊良性肠道疾病者 15 例。男 18 例，女 17 例，年龄分布 2256岁，中位年龄 37 岁。1.2 引物、探针的设计与合成 3CRD-BP RNA 引物参照 Ross 资料设计2 ，采用计算机软件辅助设计，根据引物的设计原则，设计扩增的 CRD-BP RNA 引物序列为：外引物：上游引物：5-ATCACTGTGAAGGGGGCCAT-3（20bp） ，下游引物：5-AGCTATAGGGAGCAGCCCCAG-3（21bp） ；内引物：上游引物：5-GAA TGATGTGGCTGCCATGA-3（ 20bp） ，下游引物：5-GACCTACAGCA
5、GCCAGGT TCA-3 （21bp） 。引物由上海博亚生物技术有限公司合成。按照荧光定量 PCR 探针设计要求，设计荧光定量 PCR 扩增 HCV 的探针序列为：5-FAM-CCT GCA GTC TCA CCT GAT CCC TGG C-TAMRA-3（25bp ） ， 其中 5标记的荧光发光基团是 6-羧基荧光素，3 标记的荧光淬灭基团为四甲基罗达明，探针的合成及 5端标记在中山大学达安基因诊断中心实验室 PE394 仪上合成，随后进行 3端标记及封闭。探针的纯化采用 15%聚丙烯凝胶电泳后割胶分离纯化，纯化后的探针测定其OD 值，计算其含量，置-20备用。1.3 RNA 的提取用淋
6、巴细胞分离液（北京鼎国生物制品公司）自静脉血中分离单个核细胞，采用 Trizol（北京鼎国生物制品公司）总 RNA 提取液“一步法”提取细胞总 RNA，加入 20L 无 RNase 水中溶解，4取 5L RNA 置紫外分光光度计测 OD260、OD280 及二者比值，计算 RNA 浓度。采用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性。1.4 逆转录反应和 PCR 扩增 各管总反应体积 20.0L。取 5L RNA 加入 5逆转录buffer 4.0L，外上游引物 0.4L，外下游引物 0.4L，dNTPs 0.2L，逆转录酶 MMLV（20u/L）1.0L，DEPC 水 9.0L。反应条件：37
7、 反应 60min，然后 95 灭活 3min。1.5 PCR 扩增 取逆转录产物（cDNA ）5.0L 加入 5定性 PCR buffer 5.0L，外上游引物 0.5L，外下游引物 0.5L，dNTPs 0.3L，Taq 聚合酶（3 u /L） 1.5L，逆转录产物（ cDNA ）5.0L，ddH2O 12.2L。93 变预性 2min，在 PE9600 扩增仪（美国 ABI 公司）中 93 45，55 30s，2 45min，72 min 共 20 个循环。取 cDNA（第一轮 PCR 产物）5.0L 加入 5定量PCR buffer10.0L，内上游引物 1.0L，内下游引物1.0L，
8、dNTPs 0.5L，荧光探针 1.0L，Taq 聚合酶（3u/L ）1.5L，ddH2O 30.0L。在 PE7300 扩增仪（美国 ABI 公司）中93 2min ，93 45s，55 45s，共 40 个循环。每份标本同时5检测 -actin（扩增片段大小为 220bp）作内参照，-actin 阳性为有效标本。每次实验均设阴性对照和阳性梯度对照。实验结果由电脑自动保存并分析。1.6 PCR 产物的凝胶电泳检测 CRD-BP 扩增产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳（3-4V/cm，40min ） ，用凝胶扫描系统（UVP-GDS-8000）观察。1.7 统计学方法 本实验资料采用 SPSS 11
9、. 5 统计软件，阳性率之间比较采用2 检验， P0.05 为差异有统计学意义。2 结果 2.1 RNA 的提取质量和纯度取总 RNA，用 1%琼脂糖凝胶电泳，可见 28s、18s 二条清晰的条带和稍欠清晰的 5s 条带（图 1） ，说明提取的 RNA 样品纯度较高，完整性较好，无 DNA 污染，无降解。62.2 CRD-BP RNA 在结直肠癌患者及对照组的表达及相关分析CRD-BP RNA 在 32 例结直肠癌患者（术前）外周血中的阳性表达率为 31.25%，20 例健康人外周血中的阳性表达率为 0.00%，15例良性肠道疾病患者外周血中的阳性表达率为 0.00%，CRD-BP RNA 的
10、阳性表达率差异有统计学意义（ P0.05） 。2.3 CRD-BP RNA 的表达与结直肠癌患者临床特征的关系 见表 1。表 1 CRD-BP RNA 的表达与结直肠癌临床特性的关系（略）CRD-BP RNA 在结直肠癌患者外周血中的表达与患者的年龄、性别无相关性（P0. 05） ；CRD-BP RNA 在盲肠、结肠、直肠中的阳性表达率、在不同大小肿瘤中的阳性表达率差异均无统计学意义（P0.05） 。2.4 CRD-BP RNA 的表达与结直肠癌患者病理学特征的关系见表 2。表 2 CRD-BP RNA 的表达与结直肠癌临床特征的关系（略）7CRD-BP RNA 在高、中、低分化腺癌中的阳性表
11、达率差异无统计学意义（P 0. 05） 。浸润浆膜内和浆膜外的 CRD-BP RNA 表达率差异也无统计学意义（P0. 05） 。CRD-BP RNA 在有、无淋巴结转移患者外周血中的阳性表达率差异有统计学意义（P0. 05） 。在 32 例结直肠癌患者中，A+B 期 CRD-BP RNA 阳性表达率低于C+D 期（P0. 05） 。其中 C 期阳性表达率为 40%（4/10） ，D 期中阳性表达率为 100%（2/2 ） 。3 讨论c-myc 基因最早是 1982 年 Neel3于禽类骨髓瘤病毒MC29 中发现的一种癌基因，其定位于 8q24 区， 由 3 个外显子和 2 个内含子组成。通常
12、 c-myc mRNA 半衰期是 1530min，在某些细胞中它的半衰期却长达 2h 或更长。 1992 年 Berstein PL4等国外学者发现 c-myc mRNA 有一段 RNA 片段（CRD） ，它对 c-myc mRNA 的稳定性有很大影响，并且发现它和一个分子量约 70kD 的多聚核糖体联合的蛋白结合，从而使 c-myc mRNA稳定。CRD 区是影响 c-myc 半衰期的主要因素及转录后调节的一种重要因素5 。Berstein PL4 等发现一个约 70kD 的多聚核糖体联合的蛋白（CRD-BP）在正常情况下和 c-myc 编码区决定子结合并保护 mRNA 的这个区域不被核酸内
13、切酶分解，使得 c-myc mRNA 稳定、半衰期延长、c-myc 蛋白表达上调。CRD-BP 是一8个遮蔽蛋白、癌胚蛋白，其主要功能是与 c-myc mRNA 的 CRD 区特异性结合，阻止 c-myc mRNA 被核酸内切酶分解，使得 c-myc mRNA 稳定、半衰期延长，c-myc 蛋白表达增加，从而使得细胞的性质发生变化。近年的研究发现 CRD-BP 还可以和 n-myc RNA、-actin mRNA 及 H19 RNA 等结合， 影响细胞的增殖分化。CRD-BP 受生长发育调节，正常情况下，CRD-BP 只在胚胎组织中表达，在成体组织中表达被抑制6 。在原始肿瘤和不同来源的变异细
14、胞系中重新被激活，可以检测到其表达7 ，但其激活的机制目前还不明确。既往的研究发现，CRD-BP 是一个癌胚蛋白 8 ，在乳腺癌、小细胞肺癌、结直肠癌中表达或过表达，有可能成为新的肿瘤标志物。2001 年 Ross J 等9从 21 个病人中成对地采集癌组织和正常结肠样本，应用免疫杂交技术和（或）逆转录 PCR 方法，在其中17 例样本中一或两种方法检测到 CRD-BP 阳性，除 1 例外，正常结肠样本 CRD-BP 阴性，CRD-BP 肠道炎性和绒毛状腺瘤样本也未检测到 CRD-BP。刘光军10等 RT-PCR 检测法检测大肠癌和大肠腺瘤组织，结果表明 CRD-BP 的表达可能在成年大肠癌病
15、人中被重新激活，显示其与细胞异常增生相关。王方金8利用巢式荧光实时 RT-PCR，在 43. 8%的结直肠癌患者的外周血中检测到 CRD-BP RNA 的表达，在对照组中均未检测到表达，而 CRD-BP RNA的表达与结直肠癌的 Dukes 分期有相关性。9本研究运用 FQ-nRT-PCR 方法探讨了 32 例结直肠癌患者外周血中 CRD-BP RNA 的表达情况，结果表明 CRD-BP RNA 在结直肠癌中的阳性表达率显著高于健康人和良性结直肠疾病患者，此结果与王方金的试验结果相比阳性率较低，可能与本试验样本数量较小有关。实验中 CRD-BP RNA 的表达与患者性别、年龄、发病部位、肿瘤类
16、型、肿瘤大小等临床特征无关，与结直肠癌患者临床分期相关。A+B 期结直肠癌外周血中阳性率为 15%（3/20） ，C+D 期的结直肠癌外周血阳性表达率为 58.3%（7/12） ，其中 C 期阳性率为40%（4/10） ，D 期阳性率 100%（2/2） ，这与王方金的结果相近；CRD-BP RNA 在有淋巴结转移的结直肠癌患者外周血中的阳性表达率明显高于无淋巴结转移组，以上结果提示，CRD-BP RNA 有可能成为新的结直肠癌肿瘤指标用于临床诊断；CRD-BP RNA 不仅通过延长 c-myc mRNA 半衰期，促进结直肠癌细胞的恶性转化，而且还可能参与结直肠癌细胞转移过程的调节，在转移过程中起作用，有可能成为结直肠癌预后指标。【参考文献】1Weitz J， Koch M， Debu
