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1、精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询131I作者：蔡秋琼，杜明华，陈宝安，钟英，黄科，屈海船【摘要】 目的:研究 131I标记的 Rituximab对 B细胞淋巴瘤细胞的生物学效应以及对荷人 Raji细胞移植瘤裸鼠的放射免疫治疗效果，为放射免疫导向治疗提供实验依据。方法：体外培养人 B细胞淋巴瘤细胞系 Raji细胞，裸鼠皮下接种 Raji细胞成瘤，IODO- GEN法将 131I标记于 Rituximab，将细胞分为 131I- Rituximab组、单纯抗体组、单纯核素组及空白对照组 4组，流式细胞仪检测各组 Raji细胞凋亡和细胞周期；取 30只成瘤裸鼠随机分成高、中、低剂
2、量治疗组及单纯抗体组、单纯核素组、空白对照组 6组，进行裸鼠的放射免疫治疗研究。每周测量裸鼠荷瘤大小 1次,4 周后处死裸鼠,取瘤称重，常规病理分析。结果：131I- Rituximab组凋亡率高于其他各组；131I- Rituximab组细胞周期发生变化，大部分被阻滞在G2期。裸鼠各治疗组与对照组比较，肿瘤生长减慢,肿瘤生长抑制率具有剂量时间依赖性,组织病理学检测显示治疗有效。结论：131I- Rituximab能够诱导 Raji细胞凋亡并调控细胞周期，而且可特异性地定位于肿瘤组织,发挥放射免疫导向治疗作用,具有潜在的临床应用价值。 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询【关键
3、词】 放射免疫治疗； B细胞淋巴瘤； 抗 CD20单克隆抗体； 131I-Rituximab非霍奇金淋巴瘤（NHL）是最常见的淋巴系统恶性肿瘤之一，其绝大多数是 B细胞来源，放射免疫治疗（RIT）属于内照射治疗，已成为目前 B细胞 NHL治疗的研究热点。本实验将 Rituximab-人鼠嵌合型抗 CD20单克隆抗体偶联放射性核素 131I，从体外和体内实验两方面研究其对 B细胞淋巴瘤的生物学效应。1 材料与方法1.1 细胞与实验动物人 B淋巴瘤细胞系 Raji细胞购于中国科学院上海细胞研究所；BALB/c裸鼠（46 周龄）购于中国科学院上海实验动物中心，于东南大学医学院 SPF动物房饲养。精品
4、文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询1.2 主要试剂及器材Rituximab购于罗氏制药公司，Na131I 购于南京森科公司，Iodogen(四氯二苯基甘脲)由苏州大学医学院核医学实验室提供，流式细胞仪为 FACS Vantage SE型，SPECT 显像仪为德国西门子公司E.CAM9358型。1.3 细胞培养用含 10%胎牛血清、100 Uml-1青霉素、100 Uml-1链霉素的 RPMI 1640培养液，在 37 、5%CO2、95%湿度的培养箱中培养，23 d传代 1次，取对数生长期细胞用流式细胞仪测定 CD20表达率。1.4 131I- Rituximab的制备应用 IO
5、DO- GEN法 1标记，标记产物经 Sephadex G- 25分离精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询纯化，检测标记产物的标记率及放射化学纯度。1.5 体外实验1.5.1 分组 细胞换液后 24 h，将细胞浓度调整为 1106 ml-1,分为 4组。A 组（131I- Rituximab 组）：将 131I- Rituximab加入Raji 细胞中，使 131I- Rituximab的最终比放射性活度为 3 Ciml-1（1 Ci=37 GBq） ，Rituximab 的最终浓度为 50 gml-1；B 组（单纯核素组）：将 Na131I加入 Raji细胞中，使 Na131
6、I的最终比放射性活度为 3 Ciml-1；C 组（单纯抗体组）：将Rituximab加入 Raji细胞中，使 Rituximab的最终浓度为 50 gml-1；D 组（空白对照组）：加入等量培养液。上述各组剂量参照文献2确定。1.5.2 观察指标 加药 24 h后显微镜下观察细胞形态，流式细胞仪测定细胞凋亡和细胞周期：以 Annexin - FIFC/PI双染法测定药物对细胞的早期诱导凋亡作用，采用 DNA倍体分析法检测细胞周期，重复测定 3次。精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询1.6 体内实验1.6.1 B细胞淋巴瘤动物模型的建立 将处于对数生长期的 Raji细胞，用不含血
7、清的 RPMI 1640调整细胞密度为 1107 ml-1,每只裸鼠皮下接种 0.2 ml,30 d后部分裸鼠成瘤，挑选肿瘤直径约为0.8 cm的 30只成瘤裸鼠进行实验分组。1.6.2 实验动物分组 成瘤裸鼠模型随机分为 6组（每组 5只） 。a组（高剂量组）：尾静脉注射 131I- Rituximab 400 Ci；b 组（中剂量组）：尾静脉注射 131I- Rituximab 150 Ci；c 组（低剂量组）：尾静脉注射 131I- Rituximab 50 Ci；d 组（单纯抗体组）：尾静脉注射 Rituximab 0.8 mg；e 组（单纯核素组）：尾静脉注射 Na131I 150
8、Ci；f 组（空白对照组）：尾静脉注射生理盐水 0.2 ml。上述各组剂量参照文献3确定。1.6.3 治疗效果观察 （1）观察实验动物的一般状况包括精神状况、皮肤光泽、活动度、饮食、饮水情况，并称体重；（2）每隔34 d测量肿瘤的长径和短径，根据公式计算肿瘤体积和肿瘤生长精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询抑制率（IR）：V=ab2/2（a 为长径，b 为短径） ，IR=(V0-Vn)/V0100%(V0代表非治疗组的肿瘤体积，Vn 为治疗组的肿瘤体积)；（3）SPECT 显像：分别于注射后 4、24、48、72、96、168 h 显像；（4）组织病理学检测：治疗 4周后处死裸
9、鼠分离肿瘤,称重后用 10%福尔马林固定,HE 染色，作常规病理检查。1.7 统计学处理采用 SPSS 13.0软件处理，进行方差分析，两两比较采用 LSD法。2 结 果2.1 Raji细胞形态改变及 CD20表达率倒置显微镜下可见细胞为圆形，生长旺盛，聚集成团，透明度高，折光性强。流式细胞仪测定 CD20表达率为 98.03。精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询2.2 131I- Rituximab的标记率及放化纯度131I- Rituximab采用纸层析法测其标记率为 90，其稳定性好，4 贮存 24 h，其放化纯度为 91。2.3 体外实验结果2.3.1 镜下细胞形态学改
10、变 A、B、C 组细胞生长受到抑制，数量减少，细胞收缩，胞核变小。2.3.2 细胞凋亡情况 细胞凋亡率 A组为 59.94，B、C、D 组依次为 48.21、40.40、1.06，各组间差异具有统计学意义(P 0.05)。2.3.3 细胞周期分析 （1）A 组有 17.13%的细胞截止于 S期，精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询B、C、D 组依次有 24.31%、25.73%、33.32%，除 B组和 C组之间差异没有统计学意义以外，余各组间差异有统计学意义(P 0.05)。（2）A 组有 69.01%的细胞截止于 G2期，B、C、D 组依次有65.10%、51.83%、50
11、.13%。除 A组和 B组之间以及 C组和 D组之间差异没有统计学意义外，余各组间差异具有统计学意义(P 0.05)。2.4 体内实验结果2.4.1 实验动物的一般情况 b组裸鼠精神状况、活动度、皮肤状况、饮食饮水量及体重均未发现明显异常变化；a、c 和 d组裸鼠精神情况尚可，活动度较 b组略差，饮食饮水量轻度减少；e 组和f组在实验后期裸鼠精神萎靡，皮肤暗淡，体重减轻，饮食饮水量明显减少。a 组分别在注射后第 2、3 天各有一裸鼠死亡，说明剂量过高，射线对裸鼠本身有一定伤害作用。上一页 1 2下一页2.4.2 131I- Rituximab对肿瘤的抑制情况 如图 1所示：a、b组随时间的延长
12、肿瘤体积无明显增大甚至有所缩小，c、d 组随时间的延长肿瘤体积稍增大，e、f 组随时间的延长肿瘤体积有明显增大。各组裸鼠经治疗后第 4周计算肿瘤生长抑制率，结果,精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询a、b、c、d、e 组依次为48.69、47.60%、29.60、17.27、6.81，各治疗组与对照组之间差异具有统计学意义(P 0.05)。6 组裸鼠肿瘤的增生情况及治疗后第 4周对肿瘤生长的 IR计算结果表明，肿瘤生长 IR与免疫药物之间具有剂量时间依赖性。2.4.3 SPECT显像 给药后 4、24、48 、72、96 及 168 h利用SPECT显像。于注射后 4 h肿瘤未
13、见明显显影，周围组织及血本底较高；24、48 h后 a、b、c 组可见肿瘤部位放射性浓聚（图 2） ，e组未见明显肿瘤部位浓聚；72、96 及 168 h a、b、c 3组可见肿瘤图像逐渐变浅；24 h b 组可见肿瘤部位放射性浓聚。2.4.4 病理观察结果 e、f 组肿瘤细胞增生活跃，可见较多的病理性核分裂相，偶见小灶性坏死；c、d 组瘤细胞体积缩小，病理性核分裂相可见，肿瘤细胞核固缩、结构不清、破裂，肿瘤组织见小片坏死，部分区域肿瘤细胞全部坏死、消失；a、b 组瘤细胞体积明显缩小，病理性核分裂相可见，肿瘤组织见大片坏死（图 3） 。3 讨 论精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页
14、查询放射免疫治疗（RIT）是近几年在分子靶向治疗基础上发展起来的新的治疗方法，即利用特异性抗体作载体，与能释放射线的放射性核素偶合，注入体内与肿瘤细胞特异性结合，实现对瘤体的内照射治疗，它不仅能杀伤与抗体结合的肿瘤细胞，还能杀伤邻近的不表达抗原及无法与抗体结合的细胞。RIT淋巴瘤具有许多优势4- 6：（1）淋巴瘤细胞对射线具有高度敏感性；（2）RIT 通过射线杀伤肿瘤，不必完全依赖补体依赖的细胞毒作用（CDC）和抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC） ，因此即使机体免疫缺陷、抗原表达阴性或肿瘤免疫逃避等导致抗体及免疫毒素无效时，内照射仍可发挥作用；（3）标记抗体本身固有强大的抗肿瘤效应；（
15、4）放射性核素释放的 射线能穿透多个细胞直径的距离，因此对于周围抗原表达阴性而没有结合核素的肿瘤细胞同样也有杀伤作用，这种作用称为“交叉火力作用”（cross fire） ；（5）与传统的分次、短时、高剂量外照射治疗相比，RIT 为持续性低剂量内照射治疗,避免肿瘤细胞在放疗间隔期DNA的修复,且持续低剂量辐射使肿瘤细胞被阻止在对射线敏感的细胞周期 G2期,从而增加放射性细胞毒作用。国外对该方面研究成果显著：90Y- ibritumomab和 131I- tositumomab已被 FDA批准用于精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询难治、复发性 NHL及 CD20阳性的转型 NH
16、L的治疗7 。本实验从体外和体内实验两方面研究 131I标记的 Rituximab对B细胞淋巴瘤的生物学效应：体内实验观察 131I- Rituximab对Raji细胞的早期凋亡及细胞周期的影响，体外实验观察 131I- Rituximab对荷 B细胞淋巴瘤裸鼠的治疗效果。选用 IODO- GEN法把 131I标记到 Rituximab上标记方法简单，标记率及放化纯度均在90以上，标记物稳定，证明 IODO- GEN法有很强的实用性。Raji细胞的 CD20表达率达 98.03%，证明 CD20是放免治疗 B细胞淋巴瘤的良好靶点8 ，131I- Rituximab可与 Raji细胞表面抗原 CD20特异性结合，将 131I固定到肿瘤细胞，131I 所发射的 射线对肿瘤细胞产生辐射生物效应9 ，Rituximab 在行使载体功能8的同时，其所产生的补体依赖的 CDC和 A
