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1、 带GST标签的人MIIP原核表达载体构建与鉴定 近年来研究表明，迁移侵袭抑制蛋白（ migra-tion and invasion inhibitor protein,MIIP） 在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥一定作用，能在体外抑制某些肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。2003 年 Song等首次发现，MIIP 能与胰岛素样生长因子结合蛋白 - 2（ insulin like growth factor binding protein -2,IGFBP - 2） 特异性结合，抑制神经胶质母细胞瘤细胞的侵袭能力.但对 MIIP 抗肿瘤侵袭转移能力的研究较少，其发挥作用的分子机制还不甚明确。本研究利用重组
2、 DNA 技术构建了带有GST 标签的人 MIIP 原核表达载体，并对其进行诱导表达及纯化，为进一步研究 MIIP 在肿瘤发生发展中的作用和机制提供实验基础。1 材料与方法1. 1 材料1. 1. 1 菌株和质粒 大肠杆菌 DH5 感受态和BL21 感受态为本实验室制备； pGEX - 4T - 1 质粒由北京大学肿瘤防治研究所生化与分子生物学研究室寿成超教授惠赠。1. 1. 2 主要试剂 质粒小量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自北京天根公司； 限制性内切酶 Xho I 和 EcoR I 及 T4 DNA 连接酶购自 PRO-MEGA 公司； 1kb DNA 分子量标准、蛋白分子量标准购自
3、天根公司； DNA 分子量标准（ DL15000） 购自 TaKaRa 公司。Pfu 高保真 DNA 聚合酶购自NEB 公司； Peasy - T1 载体为北京全式金生物公司产品； 异丙基硫代 - - D 半乳糖苷（ isopropyl - - D - thiogalactoside,IPTG） 、溶菌酶和 PMSF 购自 Amresco 公司； Glutathione Agarose 为 Invitrogen公司产品，Anti -GST 抗体购自Proteintech 公司，羊抗小鼠 IgG - HRP 购自北京中杉金桥生物公司。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1. 2 实验方法
4、1. 2. 1 pGEX - 4T - 1 - MIIP 原核表达载体的构建 以人乳腺癌细胞系 BICR 的 cDNA 为模板扩增出迁移侵袭抑制蛋白 MIIP 的 cDNA 全长，PCR扩增引物如下： Sense: 5- CGGAATTCAGGATG-GTGGAGGCTGAGGAAC - 3 ,Anti - sense: 5 -CCGCTCGAGTCAGGGCTTCTGCCGTGGGAC - 3,在上下游引物的 5端分别引入了 Xho I 和 EcoR I的酶切位点。PCR 反应条件为： 先 9830s,然后9810s,60 30s,72 40s,29 个循环后，最后于72 延伸 10min.
5、扩增产物加 poly - A 尾后，与Peasy - T1 载体于 25 下连接 20min,转化入E. coli DH5 感受态细胞，37 培养过夜。挑取单个阳性菌落于 LB 培养液（ 含 50gmL- 1的氨苄青霉素） 中 37震荡培养过夜，次日提取质粒，用 Xho I 和 EcoR I 双酶切进行鉴定，将鉴定正确的酶切产物回收后，与经 Xho I 和 EcoR I 双酶切的 pGEX -4T -1 进行连接，转化入 E. coli DH5感受态细胞，37 培养过夜。挑取单菌落于 LB培养液（ 含 50gmL- 1的氨苄青霉素） 中 37震荡培养过夜，次日提取质粒，用 Xho I 和 Ec
6、oR I 双酶切进行鉴定，酶切鉴定正确的质粒送上海生工生物公司测序验证。1. 2. 2 pGEX - 4T - 1 - MIIP 诱导表达条件优化将 pGEX -4T -1 - MIIP 重组质粒转化入 E. co-li BL21 感受态细胞后，挑取单克隆菌落于 3mL 的LB 培养液 （ 含 50g mL- 1的氨苄青霉素） 中37 震荡培养过夜，次日按 1 100 稀释菌液至适量 LB 培养液中（ 含 50gmL- 1的氨苄青霉素） ,37 扩增培养至 OD600nm约为 0. 8 时，分别用不同浓度的 IPTG、不同温度及不同诱导时间对重组质粒进行诱导表达。随后，4离心收集菌体沉淀，加入
7、 200L 的 PBS 垂悬后，进行 12% SDS -PAGE 电泳，考马斯亮蓝染色观察结果。1. 2. 3 GST - MIIP 融合蛋白的纯化 以最佳诱导表达条件对 pGEX -4T -1 - MIIP 诱导表达后，12000 rmin- 1,4离心，弃上清，菌体沉淀用细菌裂解液（ 含 1mgmL- 1溶菌酶，1mM PMSF,1%tritonX - 100,1. 5% 十二烷基肌氨酸钠） 冰上裂解30min 后，间歇超声至菌液清亮，12000 rmin- 1,4 离心 10min,收集上清，加入 Glutathione 琼脂糖珠，4过夜结合，次日，4离心吸去上清，Glu-tathion
8、e 琼脂糖珠经 PBS 洗涤 3 次后，用还原性谷胱甘肽洗脱液洗脱获得纯化的 GST - MIIP 融合蛋白。1. 2. 4 Western blot 鉴定 GST - MIIP 融合蛋白的表达 将上述诱导表达并纯化后的蛋白使用 10%的 SDS -PAGE 进行电泳分离，转移到 PVDF 膜上后用5%脱脂奶粉室温封闭 1h,加入 Anti - GST 抗体（ Proteintech 公司，1 50 万） 4孵育过夜，TBST（ 0.1%Tween20） 洗膜后，加羊抗小鼠 IgG - HRP 室温反应45min,TBST 洗膜后，ECL 检测显影。2 结果2. 1 pGEX - 4T - 1
9、 - MIIP 原核表达载体的构建和鉴定2. 1. 1 pEASY - T1 - MIIP 重组质粒的构建和鉴定 将 MIIP 的全长 cDNA 与 pEASY - T1 克隆载体进行连接后，获得 pEASY - T1 - MIIP 重组质粒。将其转化至大肠杆菌感受态细胞 DH5，筛选阳性克隆用 Xho I 和 EcoR I 进行双酶切鉴定，酶切图谱见图 1A.pEASY - T1 载体大小约为4900bp,MIIP 全长 cDNA 约为 1180bp,构建成功的重组质粒经酶切后可释放出大小约 4900bp 和1180bp 的两个片段。经测序，证实这三个质粒均与 GenBank 中公布的 MI
10、IP cDNA 编码区序列一致（ 序列号为： NM_021933. 2） .2. 1. 2 pGEX - 4T - 1 - MIIP 原核表达载体的构建和鉴定 将 pGEX -4T -1 质粒及上述测序验证正确的 pEASY - T1 - MIIP 载体分别用 Xho I和 EcoR I 双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶回收试剂盒回收 pGEX -4T -1 和 MIIP 的酶切产物，进行电泳鉴定。如图 1B 所示，pGEX -4T - 1 质粒约为 5400bp,MIIP 约为 1180bp.随后将 pGEX - 4T - 1 和 MIIP 的双酶切产物用 T4DNA 连接酶在室温下连
11、接，获得 pGEX - 4T - 1 -MIIP 重组质粒，将其转化至大肠杆菌感受态细胞DH5，筛选阳性克隆用 Xho I 和 EcoR I 进行双酶切鉴定，酶切图谱见图 1C.【图1】经酶切后，所选几个阳性克隆的质粒都可释放出 5400bp 大小的 pGEX - 4T - 1 和 1180bp 大小的 MIIP.选取其中两个进行测序，证实该阳性质粒均与 GenBank 中公布的 MIIPcDNA 编码区序列一致。2. 2 pGEX - 4T - 1 - MIIP 原核表达载体的诱导表达及纯化2. 2. 1 pGEX - 4T - 1 - MIIP 的诱导表达条件优化 重组原核表达载体 pGE
12、X - 4T - 1 - MIIP 构建成功后，首先对其从 IPTG 浓度、诱导温度和时间三个方面进行诱导表达条件的优化。采用0. 2、0. 5 和 1mM 的 IPTG 对 pGEX - 4T - 1 - MIIP在 37下诱导表达 3h 后，将诱导所得的菌体沉淀进行 SDS - PAGE 电泳并染色，结果显示，与未诱导菌液相比，各浓度 IPTG 的诱导菌液在 65kDa左右的位置上均可见一条明显的特异性蛋白带（ GST 标签分子量为 26kD,MIIP 蛋白分子量约为43kD,故 GST - MIIP 融 合 蛋 白 分 子 量 约 为69kD） ,且各诱导组所得蛋白量差别不大（ 图 2A
13、,箭头所示） ,考虑到 IPTG 浓度增高不利于获得可溶性的蛋白，在后续实验中 IPTG 的浓度选择在0. 2mM.【图2】随后，以 0. 2mM 的 IPTG 分别在 25、30 及37 下对 pGEX - 4T - 1 - MIIP 诱导表达 3h,以确定最佳的诱导表达温度。结果见图 2B,在 3 个温度条件下，都可获得特异性的蛋白产物（ 图中箭头所示） ,其中 30 诱导的蛋白获得量最高，37 诱导的蛋白获得量最低，同样，由于低温诱导可通过降低重组蛋白合成的速率而利于提高重组蛋白的可溶性表达，因此在后续实验中，将诱导温度确定在表达量居中的 25。最后，对 pGEX - 4T - 1 -
14、MIIP 在 0. 2mMIPTG,25 条件下分别诱导表达 1、2、4 和 6h,以确定最佳的诱导时间。从图 2C 可以看出，诱导1h 后，即可获得少量的 GST - MIIP 融合蛋白，随着诱导时间延长，蛋白表达量也逐渐增加，诱导4h 与 6h 的蛋白表达量差别不大，故后期选择的诱导时间为 4h.经过一系列的诱导表达条件的探索，确定的最佳诱导表达条件为 0. 2mM IPTG 于 25 诱导4h 后收集菌液进行后续实验。2. 2. 2 pGEX - 4T - 1 - MIIP 的诱导表达及纯化对原核表达载体 pGEX - 4T - 1 - MIIP 在确定的最佳条件下进行诱导表达后，收集诱
15、导的菌体沉淀，用酶法及超声法进行裂解，离心后收集上清，沉淀用同等体积的 PBS 垂悬后，对诱导获得的全菌、菌液上清及沉淀行 SDS - PAGE 电泳并染色，以观察所得 GST - MIIP 是否为可溶性表达。结果见图 3A,与未诱导组相比，诱导后的全菌可见明显的 GST - MIIP 融合蛋白条带。全菌经裂解后，在上清及沉淀中均可观察到 GST - MI-IP 融合蛋白条带，提示 GST - MIIP 融合蛋白部分以可溶性形式进行表达，部分形成了不溶性的包涵体。【图3】随后，采用 Glutathione 琼脂糖珠，对存在于上清中的可溶性 GST - MIIP 融合蛋白进行了纯化。由图 3B 可见，经纯化后，获得了纯度相对较高的GST - MIIP 融合蛋白。2. 2. 3 GST - MIIP 融合蛋白的 Western blot 鉴定用 Anti - GST 抗体对 GST - MIIP 融合蛋白及GST 蛋白的 Western blot 检测结果显示（ 图 4） ,在分子量为 70kD 及 25kD 左右的位置分别能检测出 1 个特异性条带，与 GST - MIIP（ 69kD） 和 GST（ 26kD） 蛋白的预期分子量大小一致，提示成功获得了具有生物学活性的 GST - MIIP
