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1、实验三 Trizol 法提取细菌总 RNA一、实验原理Trizol 主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使 RNA 释放出来的同时，保护 RNA 的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA 存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。无论是人、动物、植物还是细菌组织，Trizol 法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5106)以及大量的组织(1 g)和细胞(10 7)均有较好的分离效果。Trizol 试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。Trizol 抽提的总 RNA 能够避免 DNA 和蛋白的污染。二、主要试
2、剂和器材Trizol 溶液 氯仿 异丙醇 75%乙醇 0.1% DEPC 水超净工作台 2.0 mL 离心管（无 Rnase） 移液枪 紫外分光光度计石英比色皿 泳槽和模具 电泳仪 凝胶成像系统 大肠杆菌三、实验步骤（一）. 采用 Trizol 溶液提取细菌的总 RNA1. 挑取大肠杆菌菌单菌落，培养至稳定期，取菌液 2.0 mL 于 2.0 mL 离心管离心得菌体；2、 每管加入 1 mL Trizol 溶液，盖紧管盖，激烈振荡 15 s，室温静置 5 min 4，12000 g，离心 10 min；取上清转入(约 1 mL)新的 2.0 m L 离心管中；3、每管加入 0.2 mL 的氯仿
3、(0.2 体积 Trizol)，盖紧盖，剧烈振荡 15 s；室温静置 3 min；4, 12000 g, 离心 10 min；小心吸取上层水相，转入另一新的 2.0mL 离心管，测量其体积；（加氯仿时应充分震荡使其充分乳化。）4、 加入 1 倍体积的氯仿，盖紧盖，剧烈振荡 15 s；室温静置 3 min；4，12000 g，离心 10 min；小心吸取上层水相，转入另一已编号新的 2.0mL 离心管；5、 加入 0.5 mL 的异丙醇(0.5 体积 Trizol)，轻轻颠倒混匀；室温，静置 10 min；4，12000 g，离心 10 min，RNA 沉于管底；小心吸去上清；6、加 1 mL7
4、5%的乙醇(预冷)，并轻柔颠倒，洗涤沉淀；4，7500 g，离心 5 min；小心弃上清，微离，吸去剩余乙醇，室温干躁 10 min；7、 各管用 30L DEPC 处理过的双蒸去离子水溶解，55-60温育 5 min，分装，-80贮存(可贮存 5 周)；（二）. RNA 浓度的测定取 10 L RNA 样品以双蒸水稀释至 2 mL，转入预先以无水乙醇隔夜浸泡后晾干的石英比色皿中，小心排除气泡，以等体积的双蒸水作为空白对照，在紫外分光光度计中分别测定 260 nm、280 nm 的光吸收值，根据公式计算 RNA 的浓度。RNA 浓度(g/L)= OD 260 稀释倍数(200) 40(g/mL
5、)/1000纯 RNA 样品的 OD 260/OD280 比值为 1.82.0，若低于该值，表明存在蛋白质污染，可重新用酚氯仿抽提。该值为 2.0 时，RNA 纯度为最高。（三）. RNA 质量检测将 RNA 进行琼脂糖凝胶电泳检测，目的在于检测 23 S 和 16S 条带的完整性和它们的比值。一般认为，如果 23 S 和 16 S 条带明亮、边缘清晰，并且23 S 的亮度在 16 S 条带的两倍以上，则 RNA 的质量较好。(1) 将洗净、干燥的电泳槽和模具，水平放置在工作台上；(2) 准确称取 0.15 g 琼脂糖加入 15 mL 1 TAE 中，摇匀，在微波炉内将琼脂糖溶液以最短时间完全
6、溶解(中火档 2 min)，待冷却至 60时，加入 EB(终浓度为 L/mL)，充分混匀；(3) 插入适当的梳子，将温热的凝胶倒入胶模中，凝胶厚度为 35 mm，置于室温下凝固；(4) 待凝胶凝固后，小心移去梳子，将凝胶置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，使液面高出凝胶 12 mm；(5) 用微量移液器将样品 8L 与上样缓冲液 2L 混合并将混合液小心加入上样孔内，同时加入合适分子量范围的 DNA 分子量标准作为对照（2000bp）；(6) 盖上电泳槽盖，调节电压 100 V，电泳 15min 左右；(7) 电泳完毕后将凝胶置于紫外透射检测仪上观察结果，用凝胶成像系统照相保存。四、注意事项1. R
7、NA 制备的关键是要抑制细胞中的 RNA 分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA 分解酶的污染。EP 管及 Tip 头都要用 0.1%处理(0.1% DEPC 浸泡过夜后，高压蒸气灭菌)。用于 RNA 实验的试剂，须使用 DEPC 水处理灭菌后的玻璃容器盛装，使用的无菌水须用 0.1%的 DEPC 处理后再进行高温高压灭菌。最好在超净台内操作。2、提取时操作带一次性手套、口罩等，小心、细致、晃动及每次移液要轻；在操作过程中避免讲话等。这样做的唯一目的就是两个，一是小心 RNAse 的污染降解 RNA；二是动作过度暴力破坏 RNA 的完整性。3、电泳液需新鲜配制。电泳槽和模具需预先进行处理。4. 一般 RNA 电泳应该是做甲醛变性电泳，但是一般的琼脂糖电泳也可以，需要上样量稍微大些，并且跑电泳的时间越短越好(这样也是为了减少外界 RNAse对 RNA 的降解)，跑完电泳立刻观察。5、需要用 EB 染色，Genefinder 染色效果不好，其对双链 DNA 的效果好。6、器材的处理：尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。 （1） 用 0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在 37下处理 12 小时。 （2） 然后在 120下高压灭菌 30 分钟以除去残留的 DEPC。 RNA 实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。
