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1、项目编号西北农林科技大学大学生创新创业训练计划项目创新训练项目申请书 项目级别: 校重点 项目名称: 薯蓣内生菌发酵产物的分离与鉴定 项目负责人: 张 宇 学院、年级、专业:生命学院09级生工 联系电话: 电子邮件: 填表日期: 2012年3月28日 西北农林科技大学教务处制表一、基本情况项目名称薯蓣内生菌发酵产物的分离与鉴定项目来源自选项目负 责 人张宇性别女年龄21学号所在学院生命科学学院专业生物工程联系电话电子邮箱Z指导教师李军超性别男年龄51研究方向药用植物种质资源等职称副教授联系电话电子邮箱项目成员姓名学号学院专业项目分工汪源生命科学学院生物科学内生菌的发酵培养薛元夏生命科学学院生
2、物工程发酵产物的提取，记录数据，分析张宇生命科学学院生物工程发酵产物的鉴定，整理分析项目组人员获奖及成果情况获奖者奖励、成果名称颁发单位及时间张宇2009-2010年两次获得专业二等奖学金，2011年获专业一等奖学金，校三好学生西北农林科技大学二、立论依据1.项目的研究意义（限200字）盾叶薯蓣（Dioscorea zingiberensis CHWright）为薯蓣科薯蓣属多年生草本植物，其根状茎中所含的薯蓣皂苷元(diosgenin，俗称薯蓣皂素)是合成多种甾体激素和甾体避孕药比较理想的前体。但由于野生资源已基本耗竭，栽培盾叶薯蓣存在种质退化、易引起水土流失等因素，薯蓣皂素含量最高的仅3%
3、左右，所以选用新的薯蓣皂素清洁生产新工艺、新方法已成为皂苷类物质生产的发展趋势。根据植物内生菌具有合成和宿主植物相同或相似的活性成分的能力。盾叶薯蓣为我国特有的种，其内生菌的研究起步晚，内生细菌的研究仍属空白，尤其合成薯预皂苷元或类似物内生菌株的分离有待探索。我们已经在盾叶薯蓣中成功分离出三种可以产生皂素的薯蓣内生菌，编号分别为Syb06.11.1，Syb06.11.2，Syb.11.3。但是，这三种内生菌的发酵产物虽均为皂苷类物质，但性质有较大差异，仍需进一步鉴定。产物的鉴定，对其在医药产业中的应用具有重要价值。2.国内外研究现状分析并附主要参考文献（限1000字）自1949年薯蓣皂苷元发现
4、和利用以来，甾体激素的化学研究和工业生产迅速发展，经过结构改造，合成了类型众多的甾体激素类药物。20世纪50年代初，Marker利用霉菌氧化作用，在甾核11位引入了羟基，加之薯蓣皂苷元具有5，6位双键和3位羟基的特点，为生产甾体激素类药物奠定了良好的物质基础。薯蓣皂苷元是合成多种甾体激素和甾体避孕药较理想的前体，世界各国生产的甾体激素类药物中60%以上以此为原料。甾体激素应用广泛，发展迅速，美国仅皮质激素一类就有60多种药品上市，全球以薯蓣皂苷元为原料生产的甾体激素类药物达100多种.甾体避孕药对我国计划生育基本国策的实行有着重要作用。从1958年开始，我国就建立了以薯蓣皂苷元为主要原料的甾体
5、激素药物工业，目前国内以薯蓣皂苷元为原料合成的口服避孕药，肾上腺皮质激素和性激素达50多种，是医药工业中仅次于抗菌素的一个重要领域。薯蓣皂苷元的发现和利用，为甾体激素类药物提供了丰富而经济的天然资源。随着甾体医药工业的迅速发展，薯蓣皂苷元已成为合成甾体激素药物和避孕药物的重要工业原料。内生菌在植物体内是普遍存在的，长期生活在植物体内的特殊环境中并与宿主协同进化，一方面植物体为其提供生长必需的能量和营养；另一方面，内生菌又可通过自身的代谢产物或借助于信号传导作用对植物体产生影响。内生菌不仅能参与植物次生代谢及成分的转化合成，而且还能独立产生丰富的次生代谢产物。盾叶薯蓣植物内生菌的研究较晚。自21
6、世纪初始，国内学者先后从植株的地下茎组织中分离出丛赤壳属、镰刀菌属、支顶抱属和青霉属等真菌。Xu等从Fusarium redolen Dzf2分离株菌丝的提取物中获得了白僵菌素，抗菌实验显示其具有广谱的抗枯草芽抱杆菌、溶血性金黄色葡萄球菌、假单胞菌、根癌土壤杆菌等细菌及部分真菌的活性。zhang等，通过在发酵培养基中添加内生Fusarium redolens菌株产生的糖类真菌激发因子，使盾叶薯蓣细胞产薯预皂苷元的量提高3倍。研究结果预示，盾叶薯预内生真菌在薯预属植物的种植、加工和薯蓣皂苷元的生物转化等方面有潜在的应用价值。我们分离的3株盾叶薯蓣内生菌中，“Syb06.11.1”株的代谢产物中具
7、有与天然植物相同的薯蓣皂素，已申请国家专利。现阶段来源于植物材料的皂素提取工艺方法较多，而微生物发酵产物的提取分离工艺主要分为破壁萃取纯化三步。据此我们拟根据皂苷类物质的性质、薯蓣皂素的提取方法以及微生物发酵产物的提取方法，建立一条较为适宜的提取工艺路线，以获得内生菌的发酵产物。参考文献:1 李军超，等.盾叶薯蓣研究进展. 西北植物学报2003,23(102 新华本草纲要(第一册)M,江苏植物研究所.上海：上海科学技术出版社，1988.5. 3中国盾叶薯蓣资源现状及保护对策.资源开发与市场.2004（4）.4郑海金,等.鲜黄姜中提取薯蓣皂素新工艺研究.平顶山工学院学报，2005，14（2）5丁
8、志遵.甾体激素药源植物M，北京；科学出版社，19836唐世蓉.薯蓣科植物甾体皂甙元的含量和鉴定J，植物学报，1979，21(2)：171-1767张永忠，余龙江，徐辉碧.盾叶薯蓣的研究进展，中药材，2003，26(5)：376-3788陈战国,等. 薯蓣皂甙元的分光光度法测定J . 分析化学, 1996, 24 (2) : 227-229.9王俊等.分光光度法测定薯蓣皂苷元.分析实验室,2004,23(1):7310 姚志红,等.甲基原薯蓣皂苷含量的高效液相色谱法测定.分析测试学报,2008,27(5):55711 Xu L，Zhou L，Zhao J，LI J，etal.Fungal end
9、ophytes from Dioscorea zingiberensis rhizomes and their antibacterial activity.Lett AppI Mierobiol，2008，46:68-72.12 魏永春, 等.黄姜中薯蓣皂苷元的薄层扫描法测定.分析试验室,2006,25(11):6713 潘正, 高运玲,蔡应繁. 紫外分光光度法测定唐松草中皂苷的含量,2007,18(1):4014 徐斌,艾征.薯蓣皂甙元的极谱催化波及其应用.分析化学研究简报,2005,33(7):981三、研究方案1. 研究目标（限200字）对已分离纯化的3个盾叶薯蓣内生菌株“Syb06.
10、11.1”、“Syb06.11.2”、“Syb.11.3”进行活化、发酵培养，对其皂苷类物质进行分离纯化。a获得3个菌株产物结晶；b鉴定3个结晶物的理化性质；c发表1篇研究论文。2.研究内容（限400字）a盾叶薯蓣内生菌的发酵：利用已经分离出的3种薯蓣内生菌进行摇瓶发酵培养； b产物提取：对发酵液进行分离，提取， 纯化，为后续的实验提供原料；c产物鉴定：利用泡沫反应，醋酐-浓硫酸反应，薄层分析，熔点测定，高氯酸染色分光光度计法，紫外分光光度计法等实验方法对提纯后的产物进行检测加以鉴定；d对实验整体过程加以分析和讨论。3.拟解决的关键问题（限200字）a.对薯蓣3种内生菌发酵产物皂甙元的提取与纯
11、化；b.将3种不同内生菌的发酵产物分别加以鉴定，和标准皂甙元进行对比，同时与3种产物加以对比。4. 拟采取的研究方法及技术路线（限800字） a.对薯蓣三种内生菌Syb.06.11.1,Syb.06.11.2,Syb.06.11.3(从指导老师处获取)进行活化，进一步转移到BPA液体培养基中，进行摇瓶培养；b. 将三种培养液中分别加入适量浓盐酸，使其发酵液中盐酸浓度为2mol/l，水解4h，冷却，加NaOH中和至PH中性为止。分别将发酵液于索氏提取器中以120#石油加热回流提取4h后，取出发酵液用分液漏斗萃取，将发酵液与汽油层分离，取汽油层浓缩后，过夜使其结晶，得到三种发酵产物晶体；c.对第二
12、部得到的分离产物进行柱层析，将三种发酵产物除杂，重结晶，利用此步骤对发酵产物进行提纯；d. 利用泡沫反应，醋酐-浓硫酸反应，薄层分析，测定产物熔点，紫外分光光度计法等实验技术对提纯后的3种发酵产物皂甙元进行加以鉴定比对，同时和标准皂甙元进行横向对比分析。5实验方案（限500字）a.进一步查阅资料，优化实验方案；b.菌种复壮，活化；c.进行扩大发酵培养；d. 进行发酵产物的提取与纯化e.对发酵产物加以鉴定并分析f.实验总结，文章发表6具备的知识基础（限150字）本组成员都是生物专业的学生，掌握了与本实验相关的基础课程，有机化学，植物学，微生物学，发酵工程，生物分离工程等，并认真做过课程实验，有一
13、定的理论知识和实践操作能力，并且在实验前查阅过大量的有关内生菌发酵，发酵产物的分离，提纯，鉴定方面的文献。同时有资历深厚的老师做指导，相信通过我们组员一起的努力，我们可以做出预期的成果。7. 设备条件（限150字）LDZX-40AI 高压灭菌器 SW-C3 超净工作台 PYX-DHS-50X65型 隔水式电热恒温培养箱 CHA-S型 恒温振荡器 LS-B50L型 立式压力蒸汽灭菌器 BL-220H型 电子天平 752型 紫外光分光光度计索氏提取器，显微镜，1000ml三角摇瓶，培养皿，分液漏斗，层析柱，试管，载玻片（用于薄层分析），温度计，提勒管和毛细管（测熔点），定性滤纸，pH试纸等8.本项目的创新之处（限200字） 本实验以从植物材料中提取皂素的方法和工艺过程为基础，利用3种已经分离出的内生菌微生物发酵产生目标产物皂苷类物质，应用所掌握的实验技术重点研究探索盾叶薯蓣3种内生菌发酵产物的鉴定，拟对鉴定结果和标准薯蓣皂甙元加以对比，从而分析出3种内生菌发酵产物各自的特点及其化合物，为微生物发酵法制取皂甙元工业化生产应用提供参考。 9. 项目研究年度计划2012年2012年4月2012年6月 进一步查阅资料，优化实验方案；菌种活化2012年7月2012年8月 进行发酵生产2012年8月2012年9月 进行发酵产物的提取与纯化20
