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1、北京普利莱基因技术有限公司 电话： 010-62053186 Email: Applygen Technologies Inc.DocRev 0906Page 1 of 1HifectinIII 寡聚核苷酸真核细胞转染试剂 C1515描述：对于质粒DNA转染来说，通常是小分子脂质体包裹大分子DNA，形成的复合物表面有一层带正电荷的磷脂层，能以有效进入细胞。但是，由于短链DNA、反义寡聚核苷酸、或小 RNA片断通常明显小于普通的脂质体颗粒，因而难以被脂质体有效包裹，相反甚至是小DNA或小RNA结合在脂质体表面，因而难以被有效转染。HifectinIII是一种特殊的阳离子脂质体，专用于短的双链
2、DNA片断、单链(反义) 寡聚核苷酸、siRNA片段的真核细胞转染。这种特殊的脂质体经过特别程序制备处理后，能非常有效地包裹小DNA 或小RNA颗粒，形成带正电荷表层的稳定复合物，进而高效转染进入真核细胞。其转染高效、细胞谱广、低毒、可靠。规格：0.25 ml 转染10个24孔板，0.5 ml 转染20个24孔板，1 ml 转染40个24孔板储存：4C储存 12个月。切勿冻存。适用：短双链DNA片断、寡聚核苷酸单链、 siRNA片段转染，适用多种传代或原代细胞。细胞准备：转染前一天传0.5-2 10 5细胞于24孔板内，加1 ml正常培养基培养。 在光镜下观察细胞，当细胞群覆盖培养瓶皿生长表面
3、的 85-95%时，为 HifectinIII转染的最佳时机 。这通常需要18-24小时，但依细胞类型和量而变。传代数过多的细胞，或100%长满的细胞转化效率明显降低。小DNA溶液准备：转染前取出小 DNA或小RNA 储存液，用灭菌生理盐水或无血清无抗生素培养基，稀释到终浓度为0.1 g/ml。切记，此处较低的稀释浓度是必要的，将保证后续步骤的转染混合物具有适宜的体积以及比例，对转染试剂进行必要且适宜的稀释，进而保证形成有效的转染混合物。建议不可随意改变推荐的终浓度。制备转染复合物：按照1:10的体积比例，取4l Hifectin III，加入到40l 小DNA溶液( 浓度 0.1 g/l)中
4、，注意加样顺序不要反过来将DNA加到转染试剂中。混合均匀，置旋涡振荡器剧烈振荡。室温放置15分钟。然后将44l 转染复合物加入到956l无血清培养基，总体积 1 ml，将用于细胞转染。表1列出每孔细胞数和所需转染液的体积，据此计算需要配制的转染液的总量。考虑到移液损失，实际上要多配制一些，例如一个24孔板可按照2628孔的量来配制。表2列出具体的加样量，初始加样量参考表2的黑体栏，随后可根据细胞毒性和转染效率，加量减量进行优化。最终与细胞接触的HifectinIII不应超过8 l/ml，小DNA浓度应小于6 g/ml，否则将导致细胞毒降低转染效率。表1 培养皿、细胞数和转染终体积培养皿 面积
5、cm2 细胞数 转染终体积96-well 0.3 1 104 0.1 ml48-well 1 5 104 0.2 ml24-well 2 1 105 0.5 ml12-well 4 2 105 1 ml6-well 10 5 105 2 ml35-mm 10 5 105 2 ml60-mm 30 1 106 5 ml10-cm 75 4 106 10 ml表2 转染试剂与DNA的加样量Step 1 Step 2 Step 3 Step 4 Step 5Hifectin III 小 DNA 混合物 培养基(l) 终体积(l)减量优化 3 l 3 g/30 l 33 l 967 1000建议起始量
6、 4 l 4 g/40 l 44 l 956 1000加量优化 5 l 5 g/50 l 55 l 945 1000加最优化 6 l 6 g/60 l 66 l 934 1000转染细胞：用无血清培养基洗涤细胞1-2次，洗涤后尽量吸除孔内液体。按照表1提示的量加入适宜体积的含转染试剂的无血清培养基。孵育细胞4-6小时后，吸除转染培养基，加入含血清的正常培养基继续培养24小时以上；有时或直接将含血清培养基加到孔内，继续培养24小时以上。观察细胞，进行下一步实验。说明：悬浮细胞转染：悬浮细胞转染与上述步骤类似：(1) 离心收取细胞，用不含血清培养基洗涤2次。每1 10 6 细胞可重悬于2 ml含转染试剂的无血清培养基，加入6孔板内。
