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1、基于磁分离的化学发光发测定试剂的项目设计及初步进展2008年1月一、 项目设计背景1.国际成熟的免疫学自动检测体系及分析早在上世纪八十年代，一些知名的IVD厂商就开始全自动免疫分析仪的研制。发展到今天，市场上的全自动免疫分析仪已经非常成熟，而检测原理也有着一定的区别。对此，我们做一个简单的分析。Abbott公司，第一代产品也是目前世界上临床应用最为成功的全自动免疫分析仪，Axsystem,检测原理是：基于聚苯乙烯粒子包被，碱性磷酸酶标记(Alp)的荧光分析技术，仪器的洗涤体系为其专利的醋酸纤维吸附洗涤，洗涤及检测杯设计得非常精致，科学，保证了检测体系的特异性和精密性，因此在国内，很长一段时间里
2、，Axsystem的检测结果都作为一些项目检测的金标准。但是由于体系的检测信号为荧光信号，因此其检测量程相对较低，例如：CEA检测高限最高为500ng；从而影响了项目的检测性能。第二代产品Architect系列是基于磁珠包被的，吖啶酯标记的化学发光免疫学检测分析仪。该体系采用磁珠分离体系，吖啶酯标记的化学发光技术，吖啶酯作为化学发光法标记物，优点很多：首先缩短了检测光信号所需要的时间，其次发光集团能够在强碱的作用下脱落，之后在均匀的液相中收集光信号，使体系可能拥有更好的精密度，同时光信号的采集是对整个峰值的积分，使检测体系拥有更广的检测量程，例如：CA125在该体系的检测高限可达1500ng，
3、是Axsystem的3倍。但吖啶酯标记的化学发光技术为Bayer公司的专利，在应用上存在限制。Bayer公司（Siemens），全自动免疫检测分析体系实际是来自Ciba-corning检测体系，即：吖啶酯标记，磁珠捕获的化学发光检测体系。该体系同Architect体系一样，应用吖啶酯有专利的限制。BeckmenCoulter公司,碱性磷酸酶标记，磁珠捕获的化学发光检测体系，碱性磷酸酶标记的缺点很多：首先，作为标记物，分子量过大，在免疫学反应过程中可能存在空间位阻从而影响捕获，其次人血清中含有碱性磷酸酶的同工酶，可能存在由于非特异性吸附造成的非特异性发光反应。但是，相对于吖啶酯标记，碱性磷酸酶没
4、有专利限制，标记技术成熟，发光反应与标记物浓度之间有着良好的信号相应关系。Johnson&Johnson，HRP标记，管式捕获，该体系基本是在HRP酶标记显色的基础上略作改进，采用HRP标记技术，标记技术成熟，市场上应用时间长，整个标记体系在市场上已经非常成熟，但该体系缺点很多，管式捕获，包被流程复杂，工艺要求高，同时管间精密度也比较难控制，HRP的化学发光体系，由于整个反应非常复杂，因此，发光信号和标记物之间相应关系较差，即：发光信号与标记物浓度之间没有很好的比例关系，从而影响检出灵敏度和量程；从这点而言并不适合做量程要求较高的定量检测。Roche，以专利的电化学检测在整个免疫学检测体系中独
5、树一帜，优点很多，灵敏度高，量程广，但缺点也有，但由于有专利限制，也影响了其应用。二、 项目设计依据1.为什么选择化学发光？免疫学检测(immunoassay)是一类以抗原抗体之间发生的免疫学反应为基础的检测。根据检测过程中的最终检测信号的不同，可以分为：放免、可见光检测（optical detection）如比色类及以酶联免疫吸附为代表的吸光度检测（absorbance），光发射类（emission）主要是荧光、化学发光信号的检测。上述这几大类的检测中以可见光类的检测灵敏度最低，但由于对仪器依赖较小，检测方法成熟，收费较低，因此，在我国的广大地区有着广泛的应用；但由于测定主要以定性测试为主，
6、并且灵敏度较低，量程只有20倍左右，因此可以检测的项目非常有限，这也限制了这种方法在临床中的应用。光发射类主要有荧光和化学发光类。荧光类的信号检测包括前几年炒作非常热的时间分辨荧光检测，用于小分子检测的能量传递类检测等；相对于可见光类信号检测，荧光信号的检测灵敏度高，量程可达103左右，但荧光信号的检测受到多种因素的干扰，如标本的生物学本底，激发光波长和发射波长之间的狭窄的斯托顿位移等，都将影响检测的特异性，进而降低了检测的实际灵敏度和量程；同时仪器检测成本非常高（激发波长需要488nm的激光器），似乎更适合于多相检测。相对于其他方法，化学发光类的信号类检测灵敏度最高，检测的理论量程可达105
7、左右，但实际不同的发光体系检测灵敏度略有差异，检测量程的差别也非常大。化学发光类免疫学检测按标记物进行分类，可分为酶促化学发光免疫学检测和化学发光标记免疫学检测。化学发光标记应用的最广的标记物主要是吖啶酯类，这是一种比较理想的标记物，但由于存在严格的专利保护，因此我们基本不存在应用的可能性。酶促化学发光标记物主要有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（Alp），一般认为Alp灵敏度高于HRP，但实际上，不同的底物体系的实际检测灵敏度差异很大，而不同的检测体系实际检测量程也差别很大。本实验室测试结果显示，在同一检测体系中，已筛选出的灵敏度最佳的HRP底物体系和 Alp底物体系相比，Alp体系的量
8、程和检出灵敏度均优于HRP，并且Alp体系发光信号非常稳定，因此，就发光体系本身而言，Alp体系确实优于HRP。但是Alp的应用在免疫学检测中，存在很多其他问题，如：交联，人血清标本中内源性Alp的干扰问题等等，都限制了Alp在临床中的应用。2.为什么是磁珠？免疫学检测按检测方式来分有均相和非均相。前者由于没有洗涤过程，抗干扰性非常弱，因此，目前不是免疫学检测的主流。非均相检测又可分为基于聚苯乙烯板包被的固相反应和基于粒子（聚苯乙烯粒子或磁性粒子）包被的液相反应。相对于固相反应，液相反应优点很多，在标记物相同的情况下，液相反应有更宽的检测量程。并且，对于磁珠来说，易于洗涤，理论上检测试剂可能有
9、更好的精密度。对于制备工艺来说，采用磁珠进行包被，生产工艺简单，生产过程的人员设备成本非常低，生产流程易于控制，容易规模化。3.为什么是自动化的免疫分析体系？首先，发光法检测本身非常容易受到环境因素的影响，因此，需要较为封闭的检测体系，而酶促化学发光，对检测体系还有温控的要求，磁珠的洗涤也需要相应的配套仪器，所有这些要求，如果分拆成手工操作，将增加其不精密度和测定时的不准确度，从而削减方法学本身的优势；同时，手工法的测定模式从长远来看，应该会慢慢退出中高端的医院市场。其次，自动化的免疫分析体系的研制成功，将使我们有可能为医院提供模块式小型工作站的服务模式。根据市场上各大IVD厂商推出的仪器系列
10、，我们很清楚的看到，整合已经是将来的发展趋势，如Roche公司提供的免疫测试模块和生化测试模块，使得用户能够根据测试量的大小来自行整合，从而对实验室的检测资源进行优化。我们公司已经拥有全自动的生化分析仪，配合全自动的免疫分析仪，将使我们的检测系统更具有竞争力；从而使我们的产品在未来很长一段时间内，能够立于不败之地。三、 项目设计方案基于上述分析，我们对于化学发光免疫学检测系列试剂的开发的定位为基于磁珠包被的酶促化学发光全自动免疫分析体系。项目具体设计如下：1. 第一阶段：检测模式的确定，由于现有的应用于免疫学检测的方法主要有：夹心法和竞争法。因此，确定整个检测流程及检测模式时，应包含这两种检测
11、方法的通用模式。2. 第二阶段：完成部分目前医院里最具市场的项目开设及基本性能考核；同时，仪器开发能基本确定加样体系，洗涤体系及检测体系，初步确定仪器开发方案并完成简易的仪器测试；3. 第三阶段：完成所有开设项目的基本性能考核，仪器开发完成。4. 第四阶段：完成所有项目溯源性考核，性能考核，临床考核，开始项目申报。 5. 第五阶段：完成市场后完善，开设新的项目。四、检测模式的确定通过对市场上现有免疫学化学发光检测模式的筛选，计划采用以链霉亲和素包被的磁珠（SAMag）为固相捕获载体，以辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶作为标记物的化学发光检测模式。目前我们已经获得如下结果：1. 不同臂长生物素比较由于
12、空间位阻对SAMag的捕获效应有一定影响，因此，考核不同臂长的生物素对测定结果的影响。通过对不同臂长的生物素的考核，确定最佳臂长的生物素，用作进一步的测试。2. 不同粒径SAMag的筛选由于磁珠粒径的大小决定了单位体积内SA的含量，也决定了单位体积的磁珠的捕获能力，一般来说，粒径越小则单位体积的SA含量越高，磁珠的捕获力越强；但同时粒径越小，磁珠在多次洗涤转移中的损失也较大（上吸法分离磁珠），经过测试及综合评估，最终选出合适粒径的磁珠作为固相捕获载体。3.HRP及Alp发光底物的筛选采用通用模式对来自不同供应商的底物进行检测分析。即HRP/Alp和Biotin进行交联，分别用SA包被的磁珠和S
13、A包被的发光板考核现有的HRP/Alp发光底物，现有各底物体系中，测定结果初步表明，底物是化学发光系统的决定因素。HRP现有底物的灵敏度在本系统的测试为50pg/ml,量程在103左右；Alp底物检测灵敏度在5 pg/ml，量程在104左右，相对光子数与Alp浓度之间有着良好的响应关系。4.Alp交联方法确定通过对Alp两种交联方法比较，最终选择过碘酸钠法对Alp进行抗体交联。5.HRP与Alp两种标记物发光法测定比较选用CA125作为待测物，对两种酶促化学发光法做比较，分别对灵敏度，量程，信号与浓度之间的响应关系进行测试比较，最后确定采用Alp作为酶标记物，作进一步的测试。五、相关项目测试结
14、果1.按照上述测定模式，已经完成CA125，CEA，AFP，PSA，fPSA等肿瘤标志物的抗体配对工作。并完成相关项目性能指标的测试。2.甲状腺素类测试甲状腺素类主要打算开设三个项目：总T3，总T4和TSH。目前已完成总T4的体系构建及性能考核。总T3测试正在进行中。部分项目性能初步考核结果如下：CA125 （IU/ml）总T4（ng/ml）灵敏度不高于1.0不高于15线性范围1.0500015350准确度良好良好特异性筛选400例献血员血浆，特异性良好测试部分献血员血浆，特异性良好3、稳定性测试完成CA125及总T4Alp酶接物工作液373天热稳定性考核，测试结果良好，完成肿瘤标志物类Bio
15、tin抗体复合物工作液热稳定性考核，结果良好。目前，测试结果显示，已基本Alp酶促发光的测试平台的构建，完成上述七个产品（CA125，CEA，AFP，PSA，fPSA，总T4，总T3）的校准体系及质控体系的筛选和相关稳定性测试。而进一步的性能考核及抗干扰性，校准品的溯源性测试，临床考核等都需要仪器，才能完成。六、 最终测试流程总结根据上述测试结果，现有两种测试模式：1.夹心法；2.竞争法。基本涵盖了现有的免疫学检测项目的测试模式。夹心法测试流程如下：生物素化抗体样本酶接物 3730min 加入链霉亲和素磁珠 3730min 加入发光底物 测试读数竞争法测试流程如下：生物素化抗体样本 3730min 加入链霉亲和素磁珠 酶接物 3730min 加入发光底物 测试读数七、 仪器开发模式确定根据目前实验进展，我们认为项目开发已经完成第一阶段的工作，而第二阶段已经试剂开发已经完成一部分，根据市场考核结果，进一步开发乙肝两对半项目开发，基本能满足市场需求。因此，仪器开发希望能基本确定模式，并根据设想的模式，提供简易的平台做相关模式的考核及比较，重点是加样方式，洗涤模式，孵育模式及检测；从而确定最终仪器的整个开发模式。小结人：彭波
