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1、生物工程上游技术实验综合实验设计利用不同的方法筛选和鉴定转化子摘要本次实验通过蓝白斑筛选、菌落直接 PCR、提质粒进行 PCR、酶切鉴定的实验方法，采用 A mp 抗性筛选，利用含有抗性的培养基从转化后代中筛选出转化子，然后在进行相应的鉴定试验，再从相应的重组子中提取质粒，进行酶切实验，电泳观察酶切片段的大小是否与预期的一致，从而达到实验的基本目的，基本掌握了转基因生物筛选鉴定的基本方法。关键词菌落直接 PCR 提质粒 酶切 鉴定引言在质粒载体上进行克隆时，由于重组质粒转化的大肠杆菌的量少，连接产物没有也不可能在经过分离纯化而获得纯的重组质粒，连接产物中混有载体自连而成的空载体、载体与目的片段
2、连接而成的目的重组质粒和载体与非目的片段连接而成的非目的重组质粒。同时，宿主的转化效率极低，因此，绝大部分宿主是没有被转化的，所以很有必要对转化产物进行筛选与鉴定。首先，通过抗生素抗性从转化后代中筛选出转化子。然后，通过菌落直接 PCR 从转化子中筛选出候选转基因生物。最后，从候选重组子中提取质粒，通过凝胶电泳观察质粒的大小,再利用限制性内切酶切割 大小符合的质粒.电泳观察酶切片段的大小是否与预期的一致。一、 实验目的通过不同方法组合，筛选获得转基因菌株。二、 实验原理通过抗生素抗性筛选，从转化后代中筛选出转化子。因为非转化菌没有质粒而缺乏相应的抗生素抗性，所以可将转化产物涂布在含有相应抗生素
3、的培养基上筛选，只有含有相应抗性的抗生素抗性基因才能生长繁殖形成菌落。通过菌落直接 PCR 从转化子中筛选出转基因生物，扩增出特殊目的基因片段，判断所得转化子是否为重组子。但因为 PCR 技术的高灵敏性，往往会产生假阳性结果，所以有必要进一步进行鉴定.。从候选重组子中提取质粒,通过凝胶电泳观察质粒的大小,再利用限制性内切酶切割大小符合的质粒.电泳观察酶切片段的大小是否与预期的一致. 三、使用仪器、材料1、材料实验九准备好的菌株。2、设备用具PCR 仪、恒温摇床、台式高速离心机、恒温水浴锅、琼脂糖凝胶电泳装置、电热恒温培养箱、电泳仪、超净工作台、微量移液抢、1.5mL 离心管等。3、主要试剂PC
4、R： 10 PCR buffer 、rTaq 酶dNTP mixtures：dATP, dTTP, dGTP, dCTP 各 2.5mM引物(2.5M) P1 ：GFP-F: 5-TAGTCGACTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3(Tm=65.5) ( Sal I) P2:GFP-R: 5-GCGTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3(Tm=61.5) (Xba I) 1.5% 琼脂糖凝胶 配制 LB 液体培养基：称胰蛋白胨 0.2g，酵母提取物 0.1g，NaCl 0.2g 于 100ml 的三角瓶中，加入20ml 蒸馏水搅拌溶解，然后用 NaOH 调 p
5、H 至 7.5，加塞，包扎瓶口。质粒提取：溶液 I：50 mM 葡萄糖，10 mM EDTA，25 mM Tris-HCl（pH8.0） ，用前加溶菌酶 4 mg/L溶液 II： 0.2 mol/L NaOH 溶液（内含 1% SDS）,现配现用 溶液 III（ pH4.8）: 60 mL 5 mol/L 醋酸钾，11.5 mL 冰醋酸， 28.5 mL H2O；饱和酚/氯仿/ 异戊醇（25:24:1） 、酚/氯仿（1:1 ，V/V ）TE 缓冲液（pH8.0 ）: 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA， 含 RNA 酶（RNaseA ）: 20 g/ml醋酸钠（pH5.2 ） 、
6、70% 乙醇、无水乙醇限制性核酸内切酶：Sa l I 和 RcoR I10H buffer苯酚/氯仿/异戊醇、氯仿、醋酸钠（pH5.2 ） 、无水乙醇、70%乙醇等四、实验步骤（一）转化子的筛选取连接反应转化原液 100uL，涂布与筛选培养基上，直至液体被完全吸收。倒置平板于 37继续培养 16 个小时，平板所长出的单菌落（为白色的）即为转化子。（二）菌落直接 PCR 用无菌牙签分别挑取 5 个白色单菌落,在编好号码的 PCR 反应管中的底部分别涂抹,然后在 PCR 管中配制 15L 反应体系.10 x PCR buffer 1.5ldNTP mixture 1.2l前向引物 (P1) 2.4
7、l反向引物 (P2) 2.4lrTaq 酶 0.15l 灭菌蒸馏水 7.35l 所有试剂加完后，轻轻混匀，稍离心后即可，为了防止反应混合液蒸发，可添加10l 矿物油覆盖。PCR 仪的参数设置琼脂糖凝胶电泳检测反应结束后，取 5l PCR 产品，加入 1l 6 或 10 x loading buffer，混匀后点样，电泳15min。 （三）重组质粒的大小鉴定根据电泳结果，用无菌牙签从平板上挑选 PCR 反应阳性菌落,接种于含 Amp 100g/mL 的 10mL LB 液体培养基中,37下震荡培养 12 个小时。质粒的提取：1) 吸取 1.4 ml 菌液至 1.5 ml 离心管中。2) 离心(8
8、 000r/min，1min)，弃上清液（根据菌液浓度判断是否需要重复 12 次） 。3) 加入 150 L 溶液，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。4) 加入 200 L 溶液，加盖后温和颠倒 56 次，直至呈透明状。此步骤在 5 分钟内完成。5) 加入 150 L 预冷的溶液 ，加盖后反复颠倒混匀，直至出现白色絮状沉淀，冰浴5min。6) 离心(14 000r/min，4，5min)，移取上清液于另一干净离心管。7)向上清液中加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1） ，振荡混匀抽提，离心(14 000 r/min，4，5min)，溶液将出现分层。8) 移取上层水相溶液（约 450500L）于
9、另一干净离心管，加等体积氯仿，振荡混匀抽提，离心(14 000 r/min，4，5min)，溶液将出现分层。9)移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入 1/10 体积的醋酸钠（pH5.2）和 2 倍体积无水乙醇混匀，冰浴 30min。10) 离心(14 000r/min，10min，4)，倒掉上清液。11) 加 0.5 ml 预冷的 70% 酒精振荡，洗 DNA 沉淀一次，离心 5 min，倒掉上清液。12)真空抽干或室温自然干燥.13)加 2030L TE 缓冲液使 DNA 完全溶解，室温放置 10min，降解 RNA 杂质，少量用于琼脂糖凝胶质量检测，剩余质粒-20保存备用。14) 1%琼
10、脂糖凝胶配制：称取 1g 琼脂糖粉末，加入 100ml 0.5 倍 TBE 溶液，加热熔化，稍降温后，加入 5L 溴化乙锭（EB） ，混匀，制备凝胶板，冷却后备用。15) 每位同学各取 5L 质粒 DNA 加入 1L 6loading buffer，混匀，进行点样。16)电泳条件：120v，40 min；电泳完成后，胶块通过凝胶成像系统检测，观察实验结果，并拍照记录。（四）重组质粒的酶切鉴定 DNA 浓度纯度的测定 空白测定：吸取 200 l 蒸馏水至比色杯，进行紫外光空白测定。DNA 测定：取质粒 DNA 1 l 至一干净的离心管，加入 199 l 蒸馏水稀释混匀，所有溶液加入到干净的比色杯
11、中，测定 260 nm 及 280 nm 的光吸收值；计录 DNA 浓度及OD260/OD280 比值。酶切反应酶切反应液的配制: Sal I 1l10H buffer 2lRcoR I 1l 质粒 DNA 5l ddH2O 到 20l 酶切反应条件：37水浴 23 小时。电泳检测反应结束后，向反应液中加入 2l 10loading buffer，混匀，用以停止酶切反应，所有 22l 样品均点在一个点样孔。电泳条件：100V, 20 分钟左右。四、实验结果图一 挑取进行 PCR 反应的平板菌落图二 菌落直接 PCR 电泳图 图三 摇瓶培养的阳性菌落图四 提取质粒电泳图和酶切鉴定电泳图五、实验结
12、果分析图一是 Amp 抗性筛选培养基，上面长出的菌落是转化子菌落。菌落呈白色、光滑、圆形形状。每个培养基各挑选 5 个菌落的菌种做 PCR 反应，挑选的菌落都是比较大的、清晰的、周围菌落干扰比较少的，并用油性笔在上面做 110 号标记，方便之后接种辨认。图二是菌落直接 PCR 反应后的电泳图。图中最右边是 marker。可以看出，图中标出的、号泳带扩增出特异性条带，而且比较明亮、清晰，大约为 750bp 到 1000bp 之间，与 EGFP 片段理论值相符，表明这五个菌落的菌 PCR 结果为阳性，说明第 1、2、4 、5 、6 号菌是所需鉴定的重组子。图三是取 PCR 阳性反应摇瓶培养后的照片
13、。由于 1 号菌的条带相对比较弱，因此只选取了 2、4、5 、6 号菌摇瓶培养，图中显示菌种成功培养出来，摇瓶培养成功。图四是质粒提取和酶切鉴定的电泳图。图中右边数起第一条是DL2000 的 marker 电泳带，第二条是 DL5000 的 marker 电泳带。号泳道是质粒提取的电泳带，是酶切反应的电泳道，两组电泳道依次对应 2、4 、 5、6 号菌。质粒提取的电泳图中，号电泳带有三条带条带，从下往上数，分别是超螺旋 DNA，线性 DNA 和开环 DNA。 ，因为共价闭合 DNA 是完整的，构型比较紧密，阻力比较小，所以跑的最快，线性 DNA 是环状的双链 DNA 两条链均断开了，其分子构象
14、变化，不如共价闭合的紧密，所以跑的慢点。开环 DNA 是环状双链 DNA 有一条链断开，拖着一条尾巴，显得很臃肿，阻力最大，所以跑的最慢。电泳带都大约位于 2000bp，符合理论质粒大小。且条带比较暗，说明质粒的量比较少，而杂质偏多，而检测的 OD260/OD280 值均在适合的范围内，说明纯度比较高。可能是因为蛋白质残留和实验过程中震荡多于大力损坏了质粒。检测的OD260/OD280 值均在适合的范围内，说明纯度比较高。酶切鉴定反应中，、号电泳带有清晰的三条带，、号泳带只有两条泳带。在酶切反应中，pET32-CaM5 质粒有两个酶切位点，完全酶切应得到两个片段，分别为 6131bp 和 21
15、9bp。 、号泳道中，最上面的电泳带大约在 6130bp 处，第二条大约在 219bp 处；、号泳道中，电泳带大约在 6130bp 处，符合理论值，说明 、 号泳带的菌种，也就是第 4、6 号菌是阳性，是 pET32CaM5 转化子。、号泳带的菌种，也就是 2、5 号菌是假阳性。但是电泳图中出现第三条带，说明蛋白质杂质和已降解的 DNA.有点多，操作中有待改进。六、结果和讨论这次综合实验还算是比较成功的，筛选并鉴定出、号菌是成功的 pET32CaM5 转化子大肠杆菌，得到了一定的实验预期结果。经过一个学期的基因工程实验操作和老师的悉心指导下，我对基因工程的了解更加深入，同时掌握了一定的实验操作能力，具有了某种程度的科学研究方法和思维方法。七、参考文献生物工程上游技术实验书册 田长恩 科学出版社基因工程技术 冯斌 谢先芝编著 化学化工出版社生物技术综合实验 刘晓晴编 科学出版社
