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1、1,APPLICATION OF HSCCC IN SEPARATION OF NATURAL PRODUCTS,Prof. LING-YI KONG,2,传统的天然产物化学研究工作,Column Chromatography,Thin Layer Chromatography,Traditional Research Work of Natural Products Chemistry,3,?,传统的天然产物化学研究工作，百分之九十左右的时间在 和一根柱子，一块板子打交道。,Where is the way out?,4,高速逆流色谱仪的出现，使得天然产物工作者看到了一丝曙光,Appeara
2、nce of HSCCC Our hope ,5, HSCCC分离天然产物方法学研究 HSCCC分离香豆素类化学成分研究 HSCCC分离黄酮类化学成分研究 HSCCC分离生物碱类化学成分研究 HSCCC系统分离植物提取物化学成分研究 HSCCC联用分离技术研究,主要内容：,Contents:,Methodology research of HSCCC in separation of natural products,Research of HSCCC in separation of coumarins,Research of HSCCC in separation of flavonoid
3、s,Research of HSCCC in separation of alkaloids,Research of HSCCC in systematic separation of plant extract,Research of HSCCC coupled with other instruments,6,研究思路 Research pattern,HPLC分析方法的建立,HSCCC溶剂系统的选择(分配系数的测定),HSCCC分离条件优化及HSCCC分离纯化,化合物纯度测定,化合物结构鉴定,样品制备,重要成分活性研究,7,HSCCC分离天然产物方法学研究,Methodology res
4、earch of HSCCC in separation of natural products,8,分离方法建立步骤： 1. 根据化合物极性、溶解性特点，结合同类型化合物研究文献，确定备选溶剂系统。 2. 建立目标化合物的TLC、HPLC分析条件。 3. 由所建立的HPLC分析条件准确测定各目标化合物在备选溶剂系统中的分配系数。 4. 由分配系数估算相应保留时间，分离度及峰宽等色谱参数。 5. 选择性的选取具有适宜色谱参数的溶剂系统进行预试。 6. 优化预试条件，确立最佳条件。,Process of method development,9,HSCCC溶剂系统选择,（皂苷、强心苷、黄 酮苷、
5、多酚类等）,（香豆素、醌类、苯丙 素、生物碱、黄酮等）,（萜类、甾体、脂肪酸等）,Selection of solvent systems,10,HPLC法测定分配系数的理论基础,Theoretical base of K-value determination by HPLC,11,分配系数(KD) 与保留因子() 关系研究,（VRVM）/ VM, KD（VS / VM） KD 相比,VR VM KDVS,Relationship of KD and K,12,分配系数(K) 与分离度(Rs) 关系研究,Relationship of K and Rs,13,HSCCC峰宽度与分配系数K的关
6、系,Relationship of K and peak width,14,峰宽分配系数关系图,保留时间峰宽分配系数关系图,15,分离度与分配系数关系,在螺旋管体积为300ml，相比为1，流速为2ml/min时， tM=75min,K2/K1 1.2：Rs1.0, 两组分峰重叠小于2% K2/K1 1.31：Rs1.5, 两组分峰重叠小于1% 两组分分离程度的判断依据,16,Research of HSCCC in separation of coumarins,17,白花前胡 P. praeruptorum Dunn.,紫花前胡 P. decursivum (Miq.) Maxim,前胡 Q
7、ian-hu,1 化学成分研究进展 以香豆素类化合物为主 白花前胡: 以7,8-二氢吡喃骈香豆素类化合物为主 紫花前胡: 以6,7-二氢吡喃骈香豆素类化合物为主 2 药理研究进展 心血管系统保护作用 抗血小板凝集作用 抗过敏作用 祛痰作用 抗癌作用,18,白花前胡和紫花前胡石油醚提取物HPLC色谱图,色谱柱：SPHERIGEL ODS C18 (250 mm 4.6 mm I.D., 5 m) 流动相：乙腈-水 梯度洗脱模式： 0-15 min，乙腈比例由50%线性变为60% 15-30 min，由60%线性变为70% 35min后，70%乙腈,色谱柱：SPHERIGEL ODS C18 (2
8、50 mm 4.6 mm, 5 m) 流动相：乙腈-水 梯度洗脱模式： 0-24min，50%乙腈 24-40min，乙腈由50%线性变为65%,19,分离条件的摸索,针对香豆素类化合物具有较低极性的特点，采用经济适用环保的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:47:63)系统，流速12ml/min，分离温度2035 C ，根据等度洗脱各峰保留时间以及分离度决定是否采用梯度模式以及相应梯度条件。,分离条件,溶剂系统,螺旋管的转速,流动相的流速,分离温度,梯度模式,Solvent system,Flow rate,Revolution speed,Column temperature,Gradie
9、nt mode,Separation condition,20,白花前胡各溶剂系统的K值测定,21,紫花前胡各溶剂系统的K值测定,22,白花前胡HSCCC溶剂体系中石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5:5:5:5）以及（5:5:6.5:3.5）较为合适，采用梯度洗脱可使各目标化合物均具有较好分离度，适宜的峰宽和保留时间。而紫花前胡HSCCC溶剂体系中石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5:5:7:4）效果较为理想。,23,白花前胡和紫花前胡石油醚提取物HSCCC色谱图,螺旋管转速：900r/min 流动相流速：2.0 mL/min 分离温度：35C 流动相梯度模式： 0-150min:石油醚-乙酸乙酯-甲醇
10、-水（5:5:5:5） 的下相 150-300min: 由5:5:5:5的下相线性变为5:5:6.5:3.5的下相 300min后: 流动相为5:5: 6.5:3.5的下相,螺旋管转速：900r/min 流动相流速：2.0 mL/min 分离温度：20C 溶剂系统： 石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5:5:7:4，v/v），上相为固定相，下相为流动相,24,Journal of Chromatography A. 2004, 1057(1-2): 89-94. 2005, 1076(1-2): 127-32,25,Pd-D-V 是首次以纯化合物形式分离得到，说明了HSCCC方法的分辨能力很高。 O
11、struthin(欧芹素)首次从紫花前胡中分离得到。Ostruthin的含量并不低，但在以前的研究中未从紫花前胡中分离得到，这可能是由于该化合物在常规分离过程中易发生变化或易形成死吸附，这也说明了HSCCC方法的优越性。,小结： conclusion,26,Research of HSCCC in separation of flavonoids,27,淫羊藿 Ying Yang Huo,朝鲜淫羊藿 Epimedium koreanum Nakai.,系小檗科淫羊藿属植物(Epimedium koreanum Nakai.)的地上全草,主产于我国的辽宁、吉林等地 1 化学成分研究进展 8-异戊
12、烯基取代的黄酮类化合物 2 药理研究进展 心脑血管、免疫系统、骨代谢、生殖系统等具有广泛的药理作用, 还有抗肿瘤作用,28,样品的制备,60C干燥 粉碎至约30目,1000g药材 10L70%乙醇回流提取2次,浸膏上D101大孔 吸附树脂柱,水洗至无色，5L70%乙醇洗脱,减压旋转蒸发至干 11.5 g干粉,回收溶剂,Preparation of sample,29,色谱柱：YWG C18 柱(200 mm 4.6 mm I.D., 10 m)； 流动相：乙腈-水 0-12 min: 28%乙腈 12-20 min: 乙腈由28% 线性变为35% 30 min:35%乙腈 流动相流速：1.0
13、mL/min,HPLC分析方法建立,HPLC analysis,30,乙酸乙酯-水：Icariside II的纯度仅有68.2% 乙酸乙酯-甲醇-水(5:1:5)： 只有icariin 的纯度较高，Icariside II 和 epimedokoreanoside I 的纯度较低，均不足80% 当用乙酸乙酯-甲醇-水 (5:2:5) ：所有的化合物的纯度均较差。 氯仿-甲醇-水系统：,分离条件的摸索,根据黄酮极性特点，尝试采用乙酸乙酯-甲醇-水(5:03:5)，氯仿-甲醇-水(4:2.54:2)等体系：,适宜比例为4:3.5:2，此时各目标化合物均具有较好分离度，合适的峰宽和保留时间。,Sep
14、aration condition,31,螺旋管转速：900r/min 流动相流速：2.0 mL/min 分离温度：25C 溶剂系统： 氯仿-甲醇-水 4:3.5:2上相为固定相，下相为流动相,HSCCC色谱图,Journal of Chromatography A. 2005, 1064(1): 53-7,32,Research of HSCCC in separation of alkaloids,33,吴茱萸 Wu Zhu Yu,吴茱萸 Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth (E. rutaecarpa),为芸香科植物吴茱萸Evodia rutaecarpa (
15、Juss.) Benth.的近成熟果实，分布陕西、甘肃、安徽、浙江、福建、湖北、湖南、四川、贵州、云南、广东和广西等省区。秋季果实将近成熟尚未开裂时采收，除去果柄，晒干或烘干。 1 化学成分研究进展 主含生物碱：吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸因碱、羟基吴茱萸碱、吴茱萸卡品碱。 2 药理研究进展 胃肠道作用，镇痛，中枢刺激，止血止泻等,34,色谱柱：SPHERIGEL ODS C18 (250mm4.6mm I.D., 5um) 流动相：甲醇-乙腈-水 0-22 min: 15:38:47 22-65 min: 45:38:17 流动相流速：1.0 mL/min 检测波长：254nm,HPLC分析
16、方法建立,吴茱萸乙酸乙酯超声提取物（生物碱部位）,HPLC analysis,35,乙酸乙酯-水：生物碱基本分布于固定相中； 乙酸乙酯-甲醇-水： 当甲醇含量稍高时系统不易分层； 环己烷乙酸乙酯甲醇水：在引入环己烷后改善了系统分层状况。其中甲醇比例较小时，出峰延迟，峰型过宽；甲醇比例较大时固定相保留不理想。,分离条件的摸索,根据此类生物碱极性特点，尝试采用乙酸乙酯-水，乙酸乙酯-甲醇-水，环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 (5:5:57:5)等体系：,确定适宜比例为5:5:7:5。,Separation condition,36,HSCCC色谱图,螺旋管转速：900r/min 流动相流速：2.0 mL/min 分离温度：25C 溶剂系统： 环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 5:5:7:5上相为固定相，下相为流动相,Journal of Chromatograp
