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1、学 海 无 涯,河南省科技攻关计划项目 申请书,0,姓,名： JiangDongbao,项目名称： FGFR4 表达对结直肠癌细胞株生物学行为 的影响及作用机制的研究 单位： 郑州大学 联系电话： 填 报 说 明 请根据自己的专业及研究方向，针对某具体临床问题，结合所学习临床科研方法的 一种或几种写出一份科研设计。完成后， 文件以个人姓名命名， 发至： 。考核成绩依设计书优略评定。截至日期 2013 年 11 月 8 日。,一、项目的立项依据和意义（说明国内外相关领域技术发展水平和趋势等）,学 海 无 涯 结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是起源于结直肠黏膜上皮的恶性肿瘤，
2、是临床最常 见的恶性肿瘤之一。我国每年结直肠癌新发病例超过 25 万，死亡病例约 14 万，新发与死 亡病例均占全世界同期结直肠癌病例的 20%1。局部进展期结直肠癌 5 年癌症相关生存率 为 70%，而发生远处转移的晚期结直肠癌 5 年生存率仅为 12%，且生活质量低。目前结直 肠癌新辅助化疗、辅助化疗、姑息化疗方案很多，如 ECF、DCF、奥沙利铂+氟尿嘧啶、顺 铂+氟尿嘧啶等，但其最核心的药物是氟尿嘧啶，在此基础上联合其他化疗药物。近年来， 靶向药物在结直肠癌治疗领域的研究和应用成为一大热点，作用于 EGFR 的爱必妥、作用 于 VEGF 的贝伐单抗、针对 Her-2 的赫赛汀等已进入胃
3、癌治疗的临床实验中。 成纤维生长因子受体（FGFRs）是一个多基因家族,属免疫球蛋白基因超家族成员, 是分布在多种细胞上的膜蛋白，FGFR 家族成员有 FGFR1、FGFR2、FGFR3 以及 FGFR4。 它们的特点是在胞膜外含有 3 个免疫球蛋白样结构域，一个疏水的跨膜结构，胞浆内含有 两个呈串联结构的酪氨酸激酶功能区。FGFR13 在体内是广泛分布的,而 FGFR4 主要在发 育早期大量表达,而且主要分布在视网膜和肾脏。编码 FGFR4 蛋白的 FGFR4 基因位于 5 号 染色体，5q35.1-qter，基因编号为 2264。FGFR4 蛋白是一类具有自身磷酸化活性的跨膜酪 氨酸激酶受
4、体中的一种,在胚胎发育、组织修复和血管形成等进程中起着十分重要的作用 2,3。但 FGFR4 在恶性肿瘤中的研究相对较少，Pubmed 检索该分子在胃癌中的研究仅见几 篇报道，而且研究尚不深入。但有学者认为，FGFR 家族是在恶性肿瘤诊治方面是一个新 兴的领域，有广阔的应用前景4。 FGFR4在常见的恶性肿瘤如乳腺癌、胰腺癌、横纹肌肉瘤及肾细胞癌中均呈高表达5-7。 Meijer D等报道FGFR4表达是复发性乳腺癌患者的独立的预后因素8；Milano等研究亦认为 FGFR4可以预测三苯氧胺治疗乳腺癌的疗效9。Gowardhan等10 研究报道，与良性增生相 比，FGFR4在前列腺癌中的表达显
5、著上调；FGFR4的表达与Gleason评分相关；生存分析显 示，FGFR4过表达与较差的预后相关，无病生存期缩短。Ho HK等对57对肝细胞肝癌组织 及对应的正常组织进行real time PCR定量检测FGFR4在mRNA水平的表达，统计结果显示， FGFR4的表达与患者的主要临床病理资料无相关性，可能是由于样本量较小11。Streit等12 通过免疫组化技术对137例恶性黑色素瘤组织标本进行FGFR4蛋白水平表达进行检测，结果 显示，FGFR4在恶性黑色素瘤组织标本中的表达率为45%，FGFR4的表达与肿瘤临床分期、 微溃疡形成、原发灶的数目、总生存期及无病生存期均有明显相关性，作者认为
6、FGFR4蛋 白的表达可作为恶性黑色素瘤进展的潜在指标。 自 2002 年，Bange 等13发现了 FGFR4 Gly388Arg 这一胚系多态性后，该 SNP 现已成为 了一个研究的热点。该 SNP 是位于 FGFR4 第 9 外显子 388 密码子上，碱基 G 转变为 A， 导致了 FGFR4 的氨基酸序列发生了变化，即 388 位氨基酸由甘氨酸转变为精氨酸，该位点 位于 FGFR4 的高度保守序列中。,1,2,学 海 无 涯,3,学 海 无 涯,4,学 海 无 涯,Sugiyama N, Varjosalo M, Meller P,et al. Fibroblast growth fa
7、ctor receptor 4 regulates tumor invasion by coupling fibroblast growth factor signaling to extracellular matrix degradation. Cancer Res. 2010;70:7851-61. Xu B, Tong N, Chen SQ, et al. FGFR4 Gly388Arg polymorphism contributes to prostate cancer development and progression: A meta-analysis of 2618 cas
8、es and 2305 controls. BMC Cancer 2011; 1:84. Xie MH, Holcomb I, Deuel B, Dowd P, Huang A, Vagts A, Foster J, Liang J, Brush J, Gu Q, Hillan K, Goddard A, et al. FGF-19, a novel fibroblast growth factor with unique specificity for FGFR4. Cytokine 1999;11:72935. Wu X, Ge H, Lemon B, et al. Selective a
9、ctivation of FGFR4 by an FGF19 variant does not im prove glucose metabolism in ob/ob mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of th e United States of America 2009; 106:1437984. Xinle Wu，Hongfei Ge，Bryan Lemon, et al.FGF19-induced Hepatocyte Proliferation Is Mediated through FGFR4 Activ
10、ation. Journal of biological chemistry 2010; 285:5165-70.,二、项目创新点、主要研究开发内容及目标（实施方案、技术关键、技术路线和技术经济指 标等）,5,学 海 无 涯 1.实施方案 （1）设计 4 个 FGFR4RNAi 靶点构建到慢病毒载体，进而小量包装秤病毒颗粒。然后感染 SW620 和 HCT116 结直肠癌，通过定量 PCR 和 Western blot 法检测 FGFR4 在 mRNA 和蛋白水 平的表达，筛选出干扰效果最佳的 siRNA，进行大量包装，形成 FGFR4 siRNA 稳定转染的 细胞株，FGFR4 持续低表达；
11、构建 FGFR4 过表达慢病毒载体，进而包装成病毒颗粒, 然后 感染结直肠癌细胞株，形成 FGFR4 过表达细胞株，FGFR4 持续高表达，以备后续功能实验。 2. 对 FGFR4 siRNA 稳转细胞株和 FGFR4 过表达细胞株，分别以各自未行处理的细胞株作 为对照，进行一系列的体外功能实验，以评价 FGFR4 的上调和下调对结直肠癌细胞生物学 行为的影响，包括增殖实验、克隆实验、侵袭实验、凋亡实验及细胞周期的变化；同时在 分子水平进行 Western blot 检测，以显示不同处理后，细胞增殖、侵袭、凋亡及细胞周期 相关蛋白表达的变化，如 MMP-2、p27、CyclinD1 及 Bcl
12、-xl 等。 3. 分别将 FGFR4 siRNA 稳转细胞株、FGFR4 过表达细胞株和相应的未处理的结直肠癌细胞 株皮下注射至裸小鼠（nu/nu）背部, 构建成裸小鼠结直肠癌模型。接种 6-8 周后，观测不 同处理组成瘤体积、大小等增殖指标的变化；对裸小鼠结直肠癌组织行免疫组化检测，以 了解不同处理组肿瘤细胞生物学特性相关分子表达的变化。 2研究方法和研究手段： 1.标本来源：结直肠癌细胞株 HCT116、SW620、DLD1、SW116、LS47 等均购自上海中科 院细胞所或 ATCC，按说明书培养，利用 DMEM 培养基、Gibico 美洲胎牛血清、100IU/ml 青霉素及 100u
13、g/ml 链霉素等培养细胞。BALB/c（nu-nu）裸小鼠拟购自中国科学院上海药 物研究所，合格证编号：沪动合证字 122 号；日龄：28-32 天；体重 16-20；饲养于 SPF 级 环境中。用于 FGFR4 RNAi 和过表达实验的慢病毒载体拟购自上海基凯公司。 2利用软件设计 3-4 个 FGFR4 RNAi 靶点，构建到慢病毒载体上，进而包装成病毒颗粒， 然后感染 FGFR4 高表达的结直肠癌细胞株，经 RT-PCR 和 Western blot 验证干扰效率，制 备成 FGFR4 RNAi 稳转细胞株。同样，运用慢病毒载体构建 FGFR4 过表达结直肠癌细胞株。 3.利用流式细胞
14、仪、CCK-8 及侵袭小室等对 FGFR4 RNAi 稳转株和 FGFR4 过表达细胞株进 行体外功能实验，包括增殖实验、克隆实验、侵袭实验、凋亡实验及细胞周期的变化；同 时在分子水平进行 Western blot 检测结直肠癌生物特性相关分子表达的变化。 4将 FGFR4 RNAi 稳转株、FGFR4 过表达细胞株及相应的未感染细胞株分别皮下注射入 裸小鼠背部，构建成裸鼠结直肠癌模型，进行体内实验。观测成瘤体积等细胞增殖指标， 利用免疫组化技术检测 FGFR4 不同表达的裸鼠结直肠癌模型相关分子表达的变化。,3.技术路线,见图一,学 海 无 涯,课题关键技术在于 FGFR4 RNAi 立；F
15、GFR4 过表达慢病毒载体的,FR4 RNAi 稳转结 直肠癌细胞株的,毒载体的构 FGFR4 过 系列体外 的作用,（说明已具备的试验手段、技术力量、前期科研基础情况）,实施本项目已具备的条件,三、 有效靶点大量包装,基因功能研究,成瘤的体积、大小 等增值指标的评,肿 瘤 组 织 MMP-2 、 p27 、 CyclinD1、BCL-xl,MMP-2 、 p27 、 CyclinD1、BCL-xl,增值、侵袭、 凋亡、细胞 周期变化等,In vivo,In vitro,裸鼠结直肠癌模型的构建,6,学 海 无 涯,（1）本课题申请人可独立进行的实验操作主要包括：新鲜标本 DNA 和 RNA 的
16、抽提和测 定；RT-PCR 及 real time PCR 的操作和结果分析；免疫组化技术的操作和结果分析；细胞 培养技术；蛋白抽提、浓度测定、western blot 检测靶分子蛋白表达及结果分析；siRNA 瞬时转染技术及转染效率测定；CCK-8 法检测细胞增殖实验。流式细胞术的检测，细胞 免疫荧光技术在实验室老师协助下完成。 （2).慢病毒构建 RNAi 载体及过表达载体，是一些非常成熟的技术，FGFR4 RNAi 稳转株 和 FGFR4 过表达细胞株的建立可请上海吉凯公司协助完成，而该公司为专业从事介导靶分 子上调和下调病毒载体的制备和包装，已和前期研究所在实验室有过多次成功合作先例； 而构建裸小鼠肿瘤模型亦是一项常用的研究技术，可请相关老师指导完成。 （3）本课题在叶延伟老师的带领下进行，叶老师在复旦大学附属肿瘤医院攻读肿瘤学博 士学位，期间在复旦大学实验研究中心进行了为期 1 年的博士课题实验部分的研究，独立 完成了一系列实验操作，实验结果已经发表。硕博连读期间以第一作者发表
