《极性C18亲水作用色谱强极性化合物分离专题2013课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《极性C18亲水作用色谱强极性化合物分离专题2013课件（47页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1,极性小分子分离分析,专题讲座,强极性小分子分析难点,1.我的样品是两性极性小分子化合物，反相柱不保留，怎样选择合适的色谱柱分析。 关键词：不保留 2.我的样品分析条件比较特殊，必须要进行质谱检测，要选择可以进质谱的分析条件。 关键词：质谱兼容,强极性小分子分析难点,中强极性化合物,强极性化合物,一般极性化合物,问题：疏水塌陷,问题：不保留，不溶解,强极性小分子分析解决方案,C18 甲醇中,C18 水中,强极性小分子分析解决方案,选用亲水性和极性很强的封尾试剂封尾,避免疏水塌陷的几个策略,选用短链烷基键合相且不对硅醇基封尾,选用链长更长的烷基固定相,选用大孔硅胶,对烷基链固定相进行极性基团嵌
2、入的改造,强极性小分子分析解决方案,一步法反应 较好保持了烷基链的疏水性,可调的极性基团种类和数量 增加了材料的稳定性,Polar-copolymerized 极性共聚,Polar-embeded 极性包埋,Polar-endcapped 极性封尾,破坏了烷基链的疏水性,两步反应，极性基团数量不可控,利用极性共聚技术研发出耐水的XAqua 系列色谱柱,强极性小分子分析解决方案,停流实验,强极性小分子分析解决方案,原儿茶醛,色谱条件： 色谱柱：XAqua C18(150 4.6 mm，5mm) 流动相：乙腈：1%醋酸水溶液=5:95； 柱温：30C; 流速:1.0 mL/min;,强极性小分子分
3、析解决方案,小分子酸,色谱条件： 色谱柱：XAqua C18； 流动相：100%（0.1%三氟乙酸水）；,强极性小分子分析解决方案,中性或酸性极 性小分子化合物,XAqua 系列,碱性极性小 分子化合物,解决,XAqua 系列,拖尾,一般解 决办法,流动相中加入 离子对试剂,质谱不兼容,强极性小分子分析解决方案,碱性化合物拖尾的原因，残余硅醇基与碱性化合物作用造成拖尾,针对碱性化合物，研发出专用碱性化合物的分离分析的色谱柱 XCharge 系列,设计理念：合理控制电荷密度，形成恰当的电荷屏蔽层，消除硅醇基的拖尾影响，实现载样量的提升。,强极性小分子分析解决方案,羟氨苄青霉素,色谱条件： 色谱柱
4、：XCharge C18； 流动相：A 0.1%甲酸水，B0.1%甲酸甲醇； 梯度：020 min，5%B95%B,强极性小分子分析解决方案,磺胺类碱 性小分子,色谱条件： 色谱柱：XCharge C18； 流动相：A 0.1%甲酸水， B乙腈； 梯度：030 min，5%B95%B,强极性小分子分析解决方案,超强极性怎么办，反相纯水条件下不保留,HILIC 模式,XAqua C18 流动相：100%水,XAmide 流动相：85%乙腈水,强极性小分子分析解决方案,强极性小分子分析解决方案,色谱柱：XAmino，250 mm 4.6 mm，5 mm 流动相：A:乙腈 B：水 等度：A/B =
5、85:15 流速：1.0 mL/min 柱温：35 oC 选择性：1.12 分离度：3.08,甘露醇,山梨醇,强极性小分子分析解决方案,色谱柱：XAmide，250 mm 4.6 mm，5 mm 流动相：A: 磷酸盐缓冲液 B：乙腈 等度：A/B = 30:70 流速：1.0 mL/min 柱温：35 oC,左旋肉碱,强极性小分子分析解决方案,方案特点,1.该方案基本适用于所有极性小分子化合物，普试性好。 2.该方案所有流动相都可应用于质谱，质谱兼容性好。 3.采用两种模式，增加了样品的选择性。,强极性小分子分析解决方案,样品1,样品为某CRO公司提供合成中间体小分子化合物,XAqua C18
6、 100%甲酸水,XCharge C18 100%甲酸水,S-Click XIon 乙腈甲酸铵体系,放大图,拖尾,不保留,保留好，分离好,强极性小分子分析解决方案,样品2,样品为某CRO公司提供合成中间体小分子化合物,XAqua C18 乙腈甲酸水 主峰纯度96.55%,S-Click XIon乙腈甲酸水 主峰纯度84.91%,分离度差,保留适中分离度良好,强极性小分子分析解决方案,样品3,样品为某CRO公司提供合成中间体小分子化合物,XAqua C18 100%甲酸水 主峰纯度96.55%,XCharge C18 100%甲酸水 主峰纯度96.55%,分离度差,保留弱 分离度差,保留适中 分
7、离度良好,22,亲水作用色谱与中药中强极性化合物的分离,专题讲座,主要内容,强极性化合物的分离,反相色谱,正相色谱,溶解度 与质谱联用,？,A.J. Alpert, J. Chromatogr., 499 (1990) 177.,亲水作用色谱机理及特点,亲水作用色谱,亲水作用色谱法的分离原理与正相色谱法相近的极性固定相、以高比例极性有机溶剂和低比例水的混合溶液为流动相，主要用于极性化合物的分离。被分析物质在色谱柱中的保留和其自身的极性成正比，和流动相的极性成反比。被分析物质的极性越强，在色谱柱中保留越强。增加流动相中水的比例，使流动相极性增强，则分析物保留减弱。,亲水色谱固定相,( 1) 传统
8、的正相色谱固定相，包括纯硅胶固定相、氨基键合相、二醇基键合相、氰基固定相。该类固定相对糖、有机酸、核苷等强极性化合物表现出良好的分离选择性; ( 2) 离子交换固定相，该类固定相具有很好的亲水性，表面带有较强的表面电荷，用于亲水作用色谱时表现为一种离子交换( 或排斥) /亲水作用混合色谱模式; ( 3) 专门应用于亲水作用色谱的固定相，包括酰胺类固定相、醇羟基固定相和两性离子固定相。酰胺类固定相可用于分离核苷、核苷酸、肽、糖、糖醇及有机酸等亲水化合物; 醇羟基固定相适合于分离各种糖，如单糖、二糖、糖醇、寡糖及碱基、核苷、肽和中药中的强极性组分。,强极性化合物反相模式分离,ODS Column
9、1.000mL/min A: 0.1% 甲酸/水 B: 乙腈,亲水作用色谱机理及特点,川芎强极性成分反相模式分离，UV检测（260nm）,吸附,亲水作用色谱保留机理,亲水作用色谱机理及特点,分配,A. J. Alpert, J. Chromatogr., 499 (1990) 177.,Y. Guo, J. Chromatogr. A 1074（2005）71,Y. Guo, J. Pharm. Biomed. Anal. 31（2003）1191,T.Yoshida, J. Biochem. Biophys. Meth. 60（2004）265,反相液相色谱,正相液相色谱,毛细管电色谱,离子
10、对色谱,亲水作用色谱特点,HILIC,强极性组分,亲水作用色谱机理及特点,好的保留,好的溶解度,流动相简单,大的制备规模,亲水作用色谱影响因素,亲水作用色谱影响因素及应用,(A) Keystone Carbohydrate, (B) Asahipak NH2P, (C) BetaBasic Cyano, (D) Metasil Cyano, (E) TSKGel Amide-80, (F) Cyclobond III, (G) Polyhydroxyethyl Aspartamide 0-40min， ACN：90-75%；40-80min，ACN：75%,固定相对亲水模式分离的影响,M. A
11、. Strege, Anal. Chem. 70 (1998) 2439,亲水作用色谱影响因素及应用,有机溶剂对亲水模式分离的影响,(1) epidaunorubicin, (2) daunorubicin, (3) epirubicin, (4) doxorubicin Kromasil KR100-5SIL 10% HCOONa buffer (20 mM, pH 2.9),R. P. Li, J. Chromatogr. A, 1041 (2004) 163,亲水作用色谱影响因素及应用,有机溶剂对亲水模式分离的影响,aspirin,cytosine,5mM ammonium acetat
12、e， 30,Y. Guo, J. Chromatogr. A 1074（2005）71,亲水作用色谱影响因素及应用,缓冲盐对亲水模式分离的影响,亲水作用色谱影响因素及应用,A: 6.5mM 三氟乙酸； B: 7.9mM 甲酸铵 pH 4.4 C: 6.5mM 乙酸铵 pH 5.5； D: 6.3mM 碳酸氢铵 pH 7.9,TSK Gel Amide 80 column 0-40min， ACN：90-75%；0-80min，ACN：75%,M. A. Strege, Anal. Chem. 70 (1998) 2439,pH对亲水模式分离的影响,Retention of BTEAC as a
13、 function of pH,Atlantis silica 85% ACN-0.1M NH3 pH adjusted with formic acid,ACN0.1M HCOONH4, pH 8.210.2,D.V. McCalley J. Chromatogr. A 1171（2007）46,Analysis of test solutes on Atlantis silica,亲水作用色谱影响因素及应用,柱温对亲水模式分离的影响,Y. Guo, J. Chromatogr. A 1074（2005）71,亲水作用色谱影响因素及应用,亲水作用色谱应用,血浆中叶酸化合物的检测,Nest G
14、roup HILIC column，乙腈/水（75：25）5mM乙酸铵，pH 6.9,S.D.Garbis，Anal. Chem. 73（2001）5358,亲水作用色谱影响因素及应用,单糖、寡糖分离,单糖、二糖分离 氰基柱 乙腈/水/甲酸铵 (240 mM, pH 3.0) 76:23:1,麦芽寡糖分离 氨基柱 乙腈/水/甲酸铵 (240 mM, pH 3.0) 70:29:1,A. H. Que， Anal. Chem. 74（2004）5184,亲水作用色谱影响因素及应用,糖基磷脂酰肌醇锚蛋白（GPI-APs）分离,（A）HILIC eluate； （B）PNGase F-treated
15、 HILIC eluate,M. J. Omaetxebarria, Anal. Chem. 78 (2006) 3335,亲水作用色谱影响因素及应用,MALDI-TOF mass spectra of peptides from MDP tryptic digest,皂树皂苷分离（HILICHILIC-Q-TOF-MS模式）,Y. Wang, J. Chromatogr. A, 1181 (2008) 51,亲水作用色谱影响因素及应用,中药中强极性化合物的分离,各种亲水色谱固定相用于中药水提样品的分离,川芎亲水指纹图谱研究,中药中亲水化合物的分离,中药中强极性化合物的分离,川芎样品预处理方法
16、优化,川芎水提液,上清液,中等、弱极性 反相模式分离 川芎指纹图谱,沉淀,醇溶液,强极性 亲水模式分离 川芎指纹图谱,中药中强极性化合物的分离,川芎中等、弱极性成分反相模式分离（上图）； 强极性成分反相（中图）、亲水模式分离（下图），UV检测（260nm）,川芎指纹图谱、方法学考察,存在问题与展望,亲水作用色谱法的分离机理尚不明确。关于亲水作用色谱的分离机理研究，目前存在着分配和吸附机理的争论。 亲水作用色谱固定相种类繁多，但对色谱柱评价缺乏系统的研究。与成熟的反相色谱柱评价系统相比，亲水作用色谱柱没有能够被接受的具有代表性的评价样品，大多数是以单一物质或同一类物质进行评价，这也使得选择“合适”的HILIC 色谱柱十分困难。 亲水作用色谱将在中药极性成分研究领域，特别是对一些含有复杂的极性水溶性成分的名贵药材如阿胶、冬虫夏草等的质量控制研究将发挥重要的作用。,
