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1、DNA的测序方法、原理及其应用,一、DNA序列测定概述及其发展,即核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。 其基本原理是DNA的复制反应体系中需要存在DNA聚合酶、DNA模板、寡核苷酸引物和dNTP，引物和模板退火形成双链后，DNA聚合酶在引物的引导下在模板链上沿35的方向移动，dNTP按照碱基配对原则，逐个连接在引物的3-OH末端。,1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰岛素51个 氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。70 年代后期，Sanger和Maxam-Gilbert等人又建立了核酸序 列测定的方法，Sanger双脱氧末端终止法和
2、Maxam- Gilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读”阶段， 使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样 人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序 列。,二、测序的常用方法,DNA序列测定常用方法有如下3种：,1）双脱氧链终止法测序(the chain termination method) 基本原理： 通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。,用于终止反应的双脱氧核苷酸： 将2 ，3 双脱氧核苷酸（ddNTP）参入到新合成的DNA链中，由于参入的ddN
3、TP缺乏3 羟基，因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸二酯键，DNA合成反应将中止。,脱氧核苷酸的连接,X,2）Maxam-Gilbert 化学降解法测序 基本原理： 用放射性核素标记待测DNA一侧末端 将标记DNA分为G、A+G、C+T、C 4个反应体系 用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物 电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可读出DNA序列,表-特异断裂4种脱氧核苷酸的方法,在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA的机制是： G反应-硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，其后
4、断开了C8-C9间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。 G+A反应-（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。 T+C反应-肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。 C反应-在NaCl存在时，只有C才能与肼发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。, 碱基特异性修饰及裂解,3） DNA自动化测序,特点 原理同末端终止法 标记物为荧光染料 激光扫描自动测序 结果清晰、准确、分辨率高 测序速度快 200bp/h,.,.,.,.,三、3种方法的比较,化学法没有末端终止法应用广泛，但有一个明显的优点，即所测序列来自原DNA
5、分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝，因此利用化学法可以对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况，不能通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA二级结构及蛋白质与DNA的相互作用。,.,Maxam-Gilbert法只需简单化学试剂。所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝，因此利用化学法可以对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况。但所能测定的长度要比Sanger法短一些，它对放射性标记末端 250个核苷酸以内的DNA序列效果最佳。 Sanger 法虽需要单链模板和特异寡核苷酸，并需获得大肠杆菌DNA 聚合酶IKlenow 片段的高质量酶制剂
6、，而随着M13 噬菌体和噬菌粒载体的发展，也由于现成的合成引物容易获得及测序反应日期完善，双脱氧链终止法如今远比Maxam-Gilbert法应用得广泛。 由于Sanger法既简便又快速，目前大多数测序策略都是为Sanger法而设计的。,DNA自动测序与手工测序的不同点,1）标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动测序采用4种荧光染料分别标记ddNTP或标记引物 2) 加样方式不同：手工测序，一个样品的4个测序反应物分别在不同泳道进行，而自动测序可在一个泳道内电泳 3) 检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从4种寡聚核苷酸的梯子形图谱中读出DNA序列，而自动测序则采用激光扫描器同步扫描，
7、计算机进行阅读和编辑,四、DNA序列测定的应用,1) 测序 PCR克隆测序验证 突变体检测 新基因测序 全基因组测序 系统发育及物种鉴定 2) 片段分离 个体识别：亲缘鉴定 SNP关联分析 疾病诊断等,26,一、在线分析的核心网站 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov http:/bip.weizmann.ac.il http:/au.expasy.org/tools/#primary http:/www.ebi.ac.uk/embl/ http:/www.ddbj.nig.ac.jp/ 二、本地分析的重要软件 Vector NTI Suite 6.0及以上的版本：综合分析、载体分析。 DNA Star：综合分析 Primer Premier 5.0：引物设计 Oligo 7：寡核苷酸分析，引物计算 GCG：蛋白质、核酸序列,2、核苷酸序列的生物信息分析,西南大学生物技术专业 基因工程,27,1) Genbank序列检索,.,氨基酸序列同源性分析,.,碱基序列同源性,.,分子进化树分析亲缘性关系,西南大学生物技术专业 基因工程,31,2) 蛋白序列序列创建分子分析,.,谢谢！,
