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1、,第三节 单核细胞增生李斯特氏菌及其检验 主要内容： 一、生物学特性 二、流行病学 三、检验 四、控制,第八章 食品中其它致病菌的检验,李斯特氏菌属,李斯特氏菌属包括七个种： 单核细胞增生李斯特氏菌 、绵羊李斯特氏菌 、英诺克李斯特氏菌 、威尔斯李斯特氏菌 、西尔李斯特氏菌 、格氏李斯特氏菌 、默氏李斯特氏菌。 其中单核细胞增生李斯特氏菌对人类致病性强，绵羊李斯特氏菌对人类也有一定的致病性，其余李斯特氏菌无致病性。,单核细胞增生李斯特氏菌,单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。 它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、 脑膜炎和单核细胞增多。 它广泛存在于自然界中，食品中存
2、在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。,一、生物学特性,1、形态与染色 革兰氏阳性短杆菌，大小为0.40.50.52m，在有些培养基中稍弯，多数菌体一端较大，似棒状，细胞常呈V字形排列，在较老的或生长不良的培养物中，可能形成丝状。 20-25以4根周生鞭毛运动，在37只有较少的鞭毛或1根鞭毛； 无芽孢。在血清葡萄糖蛋白胨水中能形成粘多糖荚膜。,一、生物学特性,2、培养特性 该菌营养要求不高，在20-25培养有动力，穿刺培养25天可见伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。 该菌
3、的生长范围为2-42（也有报道在0能缓慢生长），最适培养温度为35-37，在pH中性至弱碱性（pH9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在pH3.84.4能缓慢生长，在6.5% NaCl 肉汤中生长良好。,产单核细胞李斯特菌在半固体培养基中的生长情况,有动力自穿刺线向四周蔓延生长呈典型伞状生长，底部为弯月牙状,一、生物学特性,2、培养特性 在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。 在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的-溶血环。 在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)琼脂上，用45角入
4、射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。,Listeria monocytogenes,血平板,单核增生李斯特氏菌 ATCC 19117 36h，35培养,血平板,无害李斯特氏菌 ATCC 33090 36h，35培养,血平板,伊氏李斯特氏菌 ATCC 19119 24h，35培养,一、生物学特性,3、生化反应 触酶阳性，氧化酶阴性。 能发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖。 不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖。 不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解。 吲哚、硫化
5、氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性。 VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。,一、生物学特性,触酶试验,3、生化反应 过氧化氢酶，又称接触酶，能催 化过氧化氢水解为氢和氧,右为阴性 左为阳性,一、生物学特性,葡萄糖：阳性,糖酵解试验,一、生物学特性,麦芽糖 阳性,对照,一、生物学特性,七叶苷 阳性,一、生物学特性,鼠李糖 阳性,甘露醇阴性,一、生物学特性,一、生物学特性,木糖阴性,木糖阴性,一、生物学特性,尿素酶试验：有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解，产生两个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。 穿刺接种尿素琼脂斜面，35培养5天，逐日观察阴性,尿素酶试验,1 未接种 2
6、尿素酶阳性 3尿素酶阴性,一、生物学特性,硝酸盐还原试验： 接种硝酸盐肉汤，35培养5天，加入 0.2ml的试剂A,再加入0.2ml的试剂B,轻 摇混合。呈粉红色、玫瑰红色、橙色、 棕色者表明有亚硝酸盐存在，为硝酸 盐还原阳性。 若无颜色变化，须加入少量锌粉 变红者为阴性（硝酸盐未被还原） 不变为阳性（亚硝酸盐已分解成氨和氮）,硝酸盐还原试验,甲基红实验,V-P试验,一、生物学特性,4、血清型 根据菌体（O）抗原和鞭毛（H）抗原，将单增李氏菌分成13个血清型，分别是1/2a,1/2b,1/2c,3a,3c,3c,4a,4b;4ab,4c,4d,4e和“7”13个血清型。 致病菌株的血清型一般1
7、/2b,1/2c,3a,3b,3c,4a,1/2a,4b,后两型居多。,一、生物学特性,该菌对理化因素的抵抗力较强，在土壤、粪便、青贮饲料和干草内能长期存活。 对碱和盐的抵抗力较强，60-7020-30min即被杀死；70%的酒精5min，2.5%的氢氧化钠、2.5%的石炭酸、2.5%的福尔马林20min即可杀死此菌。 该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。,二、流行病学,单增李氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、污水、地表水、废水、植物、青贮饲料、烂菜中均有该菌存在，所以，动物很容易误食该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。李氏菌是条件致病菌，大多为散发病
8、例，也可因污染食品而爆发。 本菌能产生一种溶血性质的外毒素，能引起人、牛、绵羊等动物的脑膜炎，可使家兔、豚鼠等实验动物感染引起血中单核细胞增高。 可引起婴儿及新生儿的化脓性脑膜炎或脑膜脑炎，死亡率可达70%，子宫内感染的胎儿，可导致流产、习惯性流产、死胎或新生儿李斯特氏菌病。,二、流行病学,与李斯特氏菌有关的食品 肉制品（热狗、香肠） 软奶酪 鲜奶 生菜色拉,三、单核细胞增生李斯特氏菌检验,1、样品的采集: 冷冻样品：2-5 解冻，不超过18小时。若不能及时检验，应置于-15 保存 非冷冻易腐样品：应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于4 冰箱保存，在24小时之内检验。,三、单核细胞增生李斯
9、特氏菌检验,2、样品的处理: 以无菌操作采取样品25ml(g)置于灭菌均质器中,加入225ml的EB和LB增菌液,充分搅拌均匀.如不能及时检验,可保存在4冰箱中. 3、增菌培养 EB增菌液放入(30+-1)温箱中培养48h-7d.LB1增菌液放入(30+-1)温箱中培养24h,取出0.1ml加入10ml的LB2增菌液中2次增菌.,三、单核细胞增生李斯特氏菌检验,4、分离培养 将EB增菌液和LB2增菌液分别画线接种于MMA选择性培养基琼脂平板上,置(30+-1)培养48h小时,挑选可疑菌落,用白炽灯45度角斜光照射平板,该菌的菌落为灰蓝或兰色小圆形菌落. 选择MMA平板上5个以上的可疑菌落接种三
10、糖铁琼脂和SIM动力培养基,培养于(25+-1) ,观察是否有动力,且伞状或月牙状生长.一般观察,阳性者作下一步实验.,三、单核细胞增生李斯特氏菌检验,三糖铁（TSI）琼脂试验,SIM动力试验,接种三糖铁琼脂，35培养5天。,三、单核细胞增生李斯特氏菌检验,5 、纯培养 将上述有动力、伞状，并在三糖铁琼脂培养基上层下层产酸而不产硫化氢的可疑菌落接种于胰酪胨大豆琼脂培养基（YSA-YE）上，做纯培养，供做证实试验鉴定用,三、单核细胞增生李斯特氏菌检验,6、染色镜检：从YSA-YE平板上挑 取可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿 片查该菌为阳性无芽孢杆菌；用生 理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显 微镜下观
11、察，该菌出现轻微旋转或翻 滚样运动,三、单核细胞增生李斯特氏菌检验,革兰氏染色阳性,三、单核细胞增生李斯特氏菌检验,6、生化试验：将上述可疑菌落做进一步的生化试验，该菌的生化特征及种间区别如下： +为阳性；-为阴性；为有反应,三、单核细胞增生李斯特氏菌检验,6、生化试验 溶血试验：7%羊血琼脂平板，划分小格，刺种菌落。 做阳性对照和阴性对照（英诺克李斯特氏菌）。 35培养24-48小时，于明亮处观察。 单核细胞增生李斯特氏菌在 刺种点产生窄小的透明 溶血环。,三、单核细胞增生李斯特氏菌检验,三、单核细胞增生李斯特氏菌检验,6、生化试验 MR-VP试验：接种MR-VP肉汤，35 培养48小时。移
12、取1ml于洁净试管，加入5%的-萘酚 溶液6ml,再加入10%的KOH溶液0.2ml, 轻摇1min,静置20min. V-P阳性反应：红色。 剩余培养液继续培养2d, 加入甲基红指示剂5滴。 MR阳性反应：红色。,三、单核细胞增生李斯特氏菌检验,6、生化试验 糖发酵试验 接种0.5%的糖类发酵管。35培养24-48h，阴性继续培养到5天。李斯特氏菌不产气。 单增李斯特氏菌生化反应如下： 葡萄糖：阳性 麦芽糖：阳性 七叶苷：阳性 甘露醇：阴性 鼠李糖：阳性 木糖：阴性,三、单核细胞增生李斯特氏菌检验,葡萄糖：阳性,6、生化试验,三、单核细胞增生李斯特氏菌检验,鼠李糖 阳性,6、生化试验,三、单
13、核细胞增生李斯特氏菌检验,木糖阴性,6、生化试验,甘露醇阴性,三、单核细胞增生李斯特氏菌检验,6、生化试验,三、单核细胞增生李斯特氏菌检验,七叶苷 阳性,6、生化试验,三、单核细胞增生李斯特氏菌检验,麦芽糖 阳性,6、生化试验,三、单核细胞增生李斯特氏菌检验,7、小鼠毒力试验 将符合生化试验的纯培养物接种于TSB-YE中，在30培养24h，离心、浓缩，使浓缩液含细菌量1010个/ml,取0.5ml浓缩液注射小白鼠腹腔（3-5只），观察小白鼠的死亡情况。致病菌株于2-5d内死亡，同时应做已知菌对照试验。单核细胞增生李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌对小白鼠有致病性。,三、单核细胞增生李斯特氏菌检验,8、
14、协同溶血试验（CAMP) 在血平板上平行接种金黄葡萄球菌和马红球菌，在它们中间垂直接种可疑李斯特氏菌，但不要触及它们，在30 培养24-48h,检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金黄葡萄球菌接种点的单增李斯特氏菌的溶血增强，西尔斯李氏菌的溶血也增强，绵羊李氏菌在马红球菌附近的溶血也增强，有助于鉴别。,三、单核细胞增生李斯特氏菌检验,结果报告： 阳性结果：检出单核细胞增生李斯特氏菌 阴性结果：未检出单核细胞增生李斯特氏菌,四、控制,单增李斯特氏菌在一般热加工处理中能存活，热处理已杀灭了竞争性细菌群，使单增李斯特氏菌在没有竞争的环境条件下易于存活，所以在食品加工中，中心温度必须达到70持续2分钟以上。 单增李斯特氏菌在自然界中广泛存在，所以即使产品已经过热加工处理充分灭活了单增李斯特氏菌，但有可能造成产品的二次污染，因此蒸煮后防止二次污染是极为重要的。 由于单增李斯特氏菌在4下仍然能生长繁殖，所以未加热的冰箱食品增加了食物中毒的危险。冰箱食品需加热后再食用。,思考题,李斯特氏菌的糖发酵试验主要包括哪些？ 李斯特氏菌检验操作步骤有哪些？,
