{医疗药品管理}高效液相色谱在制药行业中的应用培训讲义

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1、高效液相色谱在制药行业 中的应用 应用技术发展部 2011年,北京创新通恒科技有限公司是一家面向全球的专业HPLC企业,主要致力于高效液相色谱系统研制、开发、生产和销售。 创建于2000年,公司总部位于北京市海淀区中关村高科技园区上地信息产业基地,是一家极具创造力的国家级高新技术企业。十年来一直秉承“精益求精,追求品质,值得信赖”传统,根据用户需求,在用户关键领域进行持续的技术研发。 我们拥有卓越的技术团队和专家级的一流研发人才,“CXTH DAC800工业化生产型HPLC系统”研发投产,将中国工业化色谱系统推向世界前列,这是中国大型纯化分离研发领域的一座里程碑;“CXTH Kilotide5

2、00 DNA合成仪”投入使用,弥补中国大型合成设备领域的空白。,关于我们,国家级高新技术企业,国家级软件产品企业,创新通恒,科学技术部技术创新基金,国家级、北京市创新基金,关于我们,软件著作权7项,仪器仪表协会创新金奖,DAC800大型工业化制备色谱系统BCEIA金奖,发明专利3项,实用新型专利13项,公司资质、奖项,北京创新通恒科技有限公司,北 京 钢 臣 科 技 有 限 公 司,总 经 理 办 公 室,开 发 部,财 务 部,营 销 事 业 部,中 小 设 备 加 工 中 心,应 用 技 术 发 展 部,工 业 化 设 备 加 工 中 心,上 海 办 事 处,成 都 办 事 处,广 州 办

3、 事 处,售 后 技 术 支 持 中 心,组织构架,走近我们,引言: HPLC的特点 HPLC在制药行业中的应用 药物色谱分析方法的开发 药物色谱纯化方法的建立和优化:从分析到工业制备,目 录,内容提要,引言,HPLC的特点: 高效:分离效能高 高灵敏度 应用范围广:70%以上的有机化合物可以用HPLC分析 分析速度快 条件温和,样品不被破坏 分析HPLC由于灵敏度高,快速简便,广泛地应用于药物分析 制备HPLC是目前分离与纯化领域中处理多组分复杂体系的最有效的方法,引言: HPLC的特点 HPLC在制药行业中的应用 药物色谱分析方法的开发 药物色谱纯化方法的建立和优化:从分析到工业制备,目

4、录,内容提要,分析型HPLC在制药行业中的应用,检测药物含量 天然药物化学成分复杂,有效成分可能有一个,也可以有多个,因此精确测定各有效成分的含量对药品质量控制,建立质量标准具有重要的意义。高效液相色谱法由于其专一性、灵敏度高、快速简便的特点可广泛应用于药物分析中的定量分析,尤其在干扰因素见多的时候表现出更大的优越性。 药效检测:药物代谢动力学研究,新药效能研究 检测药物残留,三七药材组分分析:,感冒清热颗粒中的葛根素有效成分分析:,半制备型HPLC在制药行业中的应用,高通量筛选活性物质 实验室规模纯化(克级),DISCOVERY ACTIVE COMPONENT 发现活性,高通量筛选活性物质

5、,中药提取物或发酵液等的分析谱图,哪个才是活性组分 ?,高通量筛选活性物质,用半制备色谱系统,对可能具有生物活性的组分,多次进样,分段制备几十毫克做活性研究,最终确定活性组分,高通量筛选活性物质,制备HPLC在制药行业中的应用,纯化药物有效成分 高附加值产品(如紫杉醇、长春碱等癌症治疗药物) 上样量大,附加值低产品(甜菊糖苷等附加值低的药物辅料) 工艺改进类产品(增大生产量或提高产品纯度类产品),制备HPLC在制药行业中的应用,小试级制备色谱系统: 方法的放大及标准品、对照品的制备。,中试级制备色谱系统: 年产公斤级至百公斤级,DAC800 型工业化色谱:年产吨级,引言: HPLC的特点 HP

6、LC在制药行业中的应用 药物色谱分析方法的开发 药物色谱纯化方法的建立和优化:从分析到工业制备,目 录,内容提要,液相色谱实验所需的基本参数 流动相:种类及配比,等度或梯度 固定相:色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数:流速 检测器参数 温度控制 进样量 以上参数即构成一个具体的HPLC方法;亦称色谱条件,药物色谱分析方法的开发,高压输液泵的选择,平流(单泵) 高压梯度 使用多台色谱泵,在泵后混合 配置灵活、简单,脱气简单 低压梯度 用单泵产生梯度,泵前混合 对脱气要求高,检测器的选择,a、紫外可见光检测器 应用最广泛的检测器,是在UV及VIS区有吸收物质检测的首选检测器。 b、示差折光

7、检测器 一种通用型的检测器,灵敏度偏低,对温度稳定性要求过高,不 能用于梯度洗脱。通常用来分析糖类及高聚物(GPC) c、荧光检测器 灵敏度极高,常用来进行痕量检测。 d、二极管阵列检测器(DAD) 可用于全波长的检测,可以测量峰纯度,可在线得到色谱图和光谱图。 e、蒸发光散射检测器 一种通用型检测器,它可以检测挥发性低于流动相的任何样品。ELSD可以用于测量无生色团物质的检测,如碳水化合物、类脂物、聚合物、不进行衍生化的脂肪酸及氨基酸、表面活性剂及结构不明又无标准的物质的检测。,根据分离模式划分的色谱柱类型,色谱柱的选择,常用色谱柱类型,1.ODS(C18)应用范围最广的填料,大部分小分子有

8、机化合物都可进行分析 2.C8、C4保留要比C18弱,适合用于大分子的多肽和蛋白类的分离纯化 3.氨基柱正反双模式,主要用于小分子糖类化合物 4.苯基柱通常用于分离含苯环的化合物 5.氰基柱正反双模式,和ODS基不同的色谱间作用力,因而氰基柱拥有独特的选择性 6.正向硅胶 7.环糊精根据物质光学性质的不同进行手性分离,进样系统的选择,六通进样阀,六通阀的构造 a. Load状态 b. Inject状态,自动进样器,为保证重现性以及峰形等,很多情况下需要使用柱温箱来控制柱温。,选配:恒温装置,引言: HPLC的特点 HPLC在制药行业中的应用 药物色谱分析方法的开发 药物色谱纯化方法的建立和优化

9、:从分析到工业制备,目 录,内容提要,药物色谱纯化方法的建立和优化:从分析到工业制备,理论的放大 设备的放大,分析型色谱:线性色谱 指组分在固定性和流动相中的平衡浓度呈正比例关系,即吸附(分配)等温线为一条直线。 用于分离和鉴别样品中的组分,为此希望能在尽可能小的进样量下,提供尽可能高的组分分辨率。,制备色谱:非线性色谱 在制备色谱中,进样量一般都比较大,例如在克量级范围,这时样品在流动相和固定相中的比例不再是正比例的关系,相对应的吸附(分配)等温线将发生弯曲。 用于分离、富集或纯化混合物中的某一或某些组分,为此需要一定的处理量,一般进样量比分析型色谱大得多。能有适当的分离度,并要考虑层析分离

10、过程的规模、速率和分离成本。,理论的放大:非线性色谱,理论的放大:非线性色谱,制 备 色 谱 峰 型,理论的放大:非线性色谱,理论的放大:非线性色谱,浓度超载进样,体积超载进样,PK,Langmuir型容量因子降低,峰形从高斯曲线变为三角形,提高样品的浓度,保持进样体积不变;取决于组分在流动相中的溶解度,峰高不变,峰变宽并呈矩形,取决于进样体积,生产效率决定于制备柱直径,需要小颗粒填料,理论的放大:过载进样,理论的放大:过载进样,理论的放大:过载进样,应尽可能选用流动相来溶解样品,但应注意样品在流动相中应有良好的溶解度。同时,若样品体积太大,分辨能力就会下降;若样品过浓,则可能在柱的顶部形成沉

11、淀。 尽管如此,为每次可分离得到更多的样品,还是应在小体积的流动相中溶解较多的样品。 可将样品溶于不同于流动相的溶剂,但用此法时需很谨慎。,设备的放大:分析设备与制备设备,设备的放大:分析设备与制备设备,设备的放大:分析设备与制备设备,分析,制备,放 大,优化分析方法的选择性,在分析柱上进行 超量载样,放大到制备柱,设备的放大:过程,完全 线性放大,设备的放大:过程,可完全线性 放大原因: 可达到30000 每米的塔板数, 几乎与10um填 料的分析柱 柱效相当,800DAC柱效测试结果图,设备的放大:过程,上样量的调整: mp/ma=lp/la * rp /ra L:柱长;m:进样量;r:色

12、谱柱内径 p: 制备柱;a:分析柱,重点1,2,2,设备的放大:公式,流速的调整: Fp/Fa = Vp/Va = Lp/La * rp /ra F:流速;V:柱体积;L:柱长; r:色谱柱内径; p: 制备柱;a:分析柱,重点2,2,2,设备的放大:公式,梯度的调整方法: tp/ta = Vp/Va * Fp/Fa F:流速;V:柱体积; t:梯度洗脱时间; p: 制备柱;a:分析柱,重点3,设备的放大:公式,example,样品: 粗品含量大约68%,白色粉末状固体,对热(能够耐受100摄氏度)和光稳定,客户要求: 纯化后纯度大于99%,单杂小于0.8%,回收率达到70%,1 step:

13、了解客户需求,从分析到制备的过程:案例,2 step: 原始样品分析,example,用分析型HPLC(填料5u甚至更小)对样品进行分离,并对流动相进行改进,直到主峰和杂质完全分离,摸索好的条件用来对以后纯化后的样品进行纯度分析。,从分析到制备的过程:案例,example,分析条件: 甲醇:乙腈:水=81:12:7 检测波长:246nm 流速:1.0mL/min 柱子:C18,5m,4.6*250mm,结果,从分析到制备的过程:案例,3 step: 分析柱模拟制备,填料粒径 10um,4.6*250mm的柱子,不加非挥发性的酸碱盐,重新摸索制备条件,主峰和杂质分离充分的条件下开始做过载实验,将

14、主峰分段收集,一般为分成10段左右,分别测定纯度,计算回收率,进一步优化制备条件,从分析到制备的过程:案例,从分析到制备的过程:案例,example,分析柱模拟制备谱图,结果,从分析到制备的过程:案例,4 step: 确定最大上样量,不断增大上样量,直到回收率明显下降 理论上样量:填料质量的3-8,可以从3逐渐增大来确定最大上样量,example,60%乙腈,进样量4时,收率为36.3%,60%乙腈,进样量3时,收率为78.9%,选择上样量为3 ,从分析到制备的过程:案例,最终确定的制备条件: 流动相:60%乙腈-水 上样量:填料质量的3 填料:XX牌-C8-10um-100A 样品溶剂:流动

15、相,从分析到制备的过程:案例,5step: 放大,分析柱模拟制备的条件及上样量等线性放大到制备柱上,重复几次,至工艺成熟后,可以每次将主峰只分为4-6段,将主峰分段收集,一般为分成10段左右,分别测定纯度,计算回收率,进一步优化制备条件,公式见前面,制备柱规格根据实际样品量来决定,从分析到制备的过程:案例,100DAC中试放大,从分析到制备的过程:案例,工业化制备系统纯化最终药物,从分析到制备的过程:案例,从分析到制备的过程:案例,纯化后的样品分析谱图,从分析到制备:5要素,1)制备的目的是在一次操作中尽 可能地多上样,所以,首先得 在分析柱上实现超载,否则, 分析柱分离得再漂亮,再在制 备柱

16、中线性放大时就因为成本 不合理而被无情地否决。 2)制备的目的是分离你所关心的组分,只要它能与其它杂质分离的好就行了,所以不要希望在分析柱上先得到所有组分的基线分离,完全没有必要! 3)制备中常常因为超载而无法使目的物与邻近杂质间达到基线分离,可以采用分段收集的方法得到指定纯度的目的物,要求越纯,单次操作的得率也越低。 4)制备中因为目的物来之不易,常常需要将纯度不合格的目的物重新上柱循环。由于重新上柱是会增加成本的,所以超载的量要平衡单次操作的纯品得量和效益与返工成本,以单位纯品数量进行成本核算,以优化最佳上样量。,Thank you and your ideas!,联系方式:张浩 13466633087 ,

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