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1、高效液相色谱在制药行业 中的应用 应用技术发展部 2011年,北京创新通恒科技有限公司是一家面向全球的专业HPLC企业，主要致力于高效液相色谱系统研制、开发、生产和销售。 创建于2000年，公司总部位于北京市海淀区中关村高科技园区上地信息产业基地，是一家极具创造力的国家级高新技术企业。十年来一直秉承“精益求精，追求品质，值得信赖”传统，根据用户需求，在用户关键领域进行持续的技术研发。 我们拥有卓越的技术团队和专家级的一流研发人才，“CXTH DAC800工业化生产型HPLC系统”研发投产，将中国工业化色谱系统推向世界前列，这是中国大型纯化分离研发领域的一座里程碑；“CXTH Kilotide5
2、00 DNA合成仪”投入使用，弥补中国大型合成设备领域的空白。,关于我们,国家级高新技术企业,国家级软件产品企业,创新通恒,科学技术部技术创新基金,国家级、北京市创新基金,关于我们,软件著作权7项,仪器仪表协会创新金奖,DAC800大型工业化制备色谱系统BCEIA金奖,发明专利3项，实用新型专利13项,公司资质、奖项,北京创新通恒科技有限公司,北 京 钢 臣 科 技 有 限 公 司,总 经 理 办 公 室,开 发 部,财 务 部,营 销 事 业 部,中 小 设 备 加 工 中 心,应 用 技 术 发 展 部,工 业 化 设 备 加 工 中 心,上 海 办 事 处,成 都 办 事 处,广 州 办
3、 事 处,售 后 技 术 支 持 中 心,组织构架,走近我们,引言： HPLC的特点 HPLC在制药行业中的应用 药物色谱分析方法的开发 药物色谱纯化方法的建立和优化：从分析到工业制备,目 录,内容提要,引言,HPLC的特点： 高效：分离效能高 高灵敏度 应用范围广：70%以上的有机化合物可以用HPLC分析 分析速度快 条件温和，样品不被破坏 分析HPLC由于灵敏度高，快速简便，广泛地应用于药物分析 制备HPLC是目前分离与纯化领域中处理多组分复杂体系的最有效的方法,引言： HPLC的特点 HPLC在制药行业中的应用 药物色谱分析方法的开发 药物色谱纯化方法的建立和优化：从分析到工业制备,目
4、录,内容提要,分析型HPLC在制药行业中的应用,检测药物含量 天然药物化学成分复杂，有效成分可能有一个，也可以有多个，因此精确测定各有效成分的含量对药品质量控制，建立质量标准具有重要的意义。高效液相色谱法由于其专一性、灵敏度高、快速简便的特点可广泛应用于药物分析中的定量分析，尤其在干扰因素见多的时候表现出更大的优越性。 药效检测：药物代谢动力学研究，新药效能研究 检测药物残留,三七药材组分分析：,感冒清热颗粒中的葛根素有效成分分析：,半制备型HPLC在制药行业中的应用,高通量筛选活性物质 实验室规模纯化（克级）,DISCOVERY ACTIVE COMPONENT 发现活性,高通量筛选活性物质
5、,中药提取物或发酵液等的分析谱图,哪个才是活性组分 ？,高通量筛选活性物质,用半制备色谱系统，对可能具有生物活性的组分，多次进样，分段制备几十毫克做活性研究，最终确定活性组分,高通量筛选活性物质,制备HPLC在制药行业中的应用,纯化药物有效成分 高附加值产品（如紫杉醇、长春碱等癌症治疗药物） 上样量大，附加值低产品（甜菊糖苷等附加值低的药物辅料） 工艺改进类产品（增大生产量或提高产品纯度类产品）,制备HPLC在制药行业中的应用,小试级制备色谱系统： 方法的放大及标准品、对照品的制备。,中试级制备色谱系统： 年产公斤级至百公斤级,DAC800 型工业化色谱：年产吨级,引言： HPLC的特点 HP
6、LC在制药行业中的应用 药物色谱分析方法的开发 药物色谱纯化方法的建立和优化：从分析到工业制备,目 录,内容提要,液相色谱实验所需的基本参数 流动相：种类及配比，等度或梯度 固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数 温度控制 进样量 以上参数即构成一个具体的HPLC方法；亦称色谱条件,药物色谱分析方法的开发,高压输液泵的选择,平流（单泵） 高压梯度 使用多台色谱泵，在泵后混合 配置灵活、简单，脱气简单 低压梯度 用单泵产生梯度，泵前混合 对脱气要求高,检测器的选择,a、紫外可见光检测器 应用最广泛的检测器，是在UV及VIS区有吸收物质检测的首选检测器。 b、示差折光
7、检测器 一种通用型的检测器，灵敏度偏低，对温度稳定性要求过高，不 能用于梯度洗脱。通常用来分析糖类及高聚物（GPC） c、荧光检测器 灵敏度极高，常用来进行痕量检测。 d、二极管阵列检测器（DAD） 可用于全波长的检测，可以测量峰纯度，可在线得到色谱图和光谱图。 e、蒸发光散射检测器 一种通用型检测器，它可以检测挥发性低于流动相的任何样品。ELSD可以用于测量无生色团物质的检测，如碳水化合物、类脂物、聚合物、不进行衍生化的脂肪酸及氨基酸、表面活性剂及结构不明又无标准的物质的检测。,根据分离模式划分的色谱柱类型,色谱柱的选择,常用色谱柱类型,1.ODS（C18）应用范围最广的填料，大部分小分子有
8、机化合物都可进行分析 2.C8、C4保留要比C18弱，适合用于大分子的多肽和蛋白类的分离纯化 3.氨基柱正反双模式，主要用于小分子糖类化合物 4.苯基柱通常用于分离含苯环的化合物 5.氰基柱正反双模式，和ODS基不同的色谱间作用力，因而氰基柱拥有独特的选择性 6.正向硅胶 7.环糊精根据物质光学性质的不同进行手性分离,进样系统的选择,六通进样阀,六通阀的构造 a. Load状态 b. Inject状态,自动进样器,为保证重现性以及峰形等，很多情况下需要使用柱温箱来控制柱温。,选配：恒温装置,引言： HPLC的特点 HPLC在制药行业中的应用 药物色谱分析方法的开发 药物色谱纯化方法的建立和优化
9、：从分析到工业制备,目 录,内容提要,药物色谱纯化方法的建立和优化：从分析到工业制备,理论的放大 设备的放大,分析型色谱：线性色谱 指组分在固定性和流动相中的平衡浓度呈正比例关系，即吸附（分配）等温线为一条直线。 用于分离和鉴别样品中的组分，为此希望能在尽可能小的进样量下，提供尽可能高的组分分辨率。,制备色谱：非线性色谱 在制备色谱中，进样量一般都比较大，例如在克量级范围，这时样品在流动相和固定相中的比例不再是正比例的关系，相对应的吸附（分配）等温线将发生弯曲。 用于分离、富集或纯化混合物中的某一或某些组分，为此需要一定的处理量，一般进样量比分析型色谱大得多。能有适当的分离度，并要考虑层析分离
10、过程的规模、速率和分离成本。,理论的放大：非线性色谱,理论的放大：非线性色谱,制 备 色 谱 峰 型,理论的放大：非线性色谱,理论的放大：非线性色谱,浓度超载进样,体积超载进样,PK,Langmuir型容量因子降低，峰形从高斯曲线变为三角形,提高样品的浓度，保持进样体积不变；取决于组分在流动相中的溶解度,峰高不变，峰变宽并呈矩形,取决于进样体积，生产效率决定于制备柱直径，需要小颗粒填料,理论的放大：过载进样,理论的放大：过载进样,理论的放大：过载进样,应尽可能选用流动相来溶解样品，但应注意样品在流动相中应有良好的溶解度。同时，若样品体积太大，分辨能力就会下降；若样品过浓，则可能在柱的顶部形成沉
11、淀。 尽管如此，为每次可分离得到更多的样品，还是应在小体积的流动相中溶解较多的样品。 可将样品溶于不同于流动相的溶剂，但用此法时需很谨慎。,设备的放大：分析设备与制备设备,设备的放大：分析设备与制备设备,设备的放大：分析设备与制备设备,分析,制备,放 大,优化分析方法的选择性,在分析柱上进行 超量载样,放大到制备柱,设备的放大：过程,完全 线性放大,设备的放大：过程,可完全线性 放大原因： 可达到30000 每米的塔板数， 几乎与10um填 料的分析柱 柱效相当,800DAC柱效测试结果图,设备的放大：过程,上样量的调整： mp/ma=lp/la * rp /ra L:柱长；m：进样量；r：色
12、谱柱内径 p: 制备柱；a：分析柱,重点1,2,2,设备的放大：公式,流速的调整： Fp/Fa = Vp/Va = Lp/La * rp /ra F：流速；V:柱体积；L:柱长； r：色谱柱内径； p: 制备柱；a：分析柱,重点2,2,2,设备的放大：公式,梯度的调整方法： tp/ta = Vp/Va * Fp/Fa F：流速；V:柱体积； t:梯度洗脱时间； p: 制备柱；a：分析柱,重点3,设备的放大：公式,example,样品： 粗品含量大约68%，白色粉末状固体，对热（能够耐受100摄氏度）和光稳定,客户要求： 纯化后纯度大于99%，单杂小于0.8%，回收率达到70%,1 step:
13、了解客户需求,从分析到制备的过程：案例,2 step: 原始样品分析,example,用分析型HPLC（填料5u甚至更小）对样品进行分离，并对流动相进行改进，直到主峰和杂质完全分离，摸索好的条件用来对以后纯化后的样品进行纯度分析。,从分析到制备的过程：案例,example,分析条件： 甲醇：乙腈：水=81：12：7 检测波长：246nm 流速：1.0mL/min 柱子：C18，5m，4.6*250mm,结果,从分析到制备的过程：案例,3 step: 分析柱模拟制备,填料粒径 10um，4.6*250mm的柱子,不加非挥发性的酸碱盐，重新摸索制备条件,主峰和杂质分离充分的条件下开始做过载实验,将
14、主峰分段收集，一般为分成10段左右,分别测定纯度，计算回收率，进一步优化制备条件,从分析到制备的过程：案例,从分析到制备的过程：案例,example,分析柱模拟制备谱图,结果,从分析到制备的过程：案例,4 step: 确定最大上样量,不断增大上样量，直到回收率明显下降 理论上样量：填料质量的3-8，可以从3逐渐增大来确定最大上样量,example,60%乙腈，进样量4时，收率为36.3%,60%乙腈，进样量3时，收率为78.9%,选择上样量为3 ,从分析到制备的过程：案例,最终确定的制备条件： 流动相：60%乙腈-水 上样量：填料质量的3 填料：XX牌-C8-10um-100A 样品溶剂：流动
15、相,从分析到制备的过程：案例,5step: 放大,分析柱模拟制备的条件及上样量等线性放大到制备柱上,重复几次，至工艺成熟后，可以每次将主峰只分为4-6段,将主峰分段收集，一般为分成10段左右,分别测定纯度，计算回收率，进一步优化制备条件,公式见前面，制备柱规格根据实际样品量来决定,从分析到制备的过程：案例,100DAC中试放大,从分析到制备的过程：案例,工业化制备系统纯化最终药物,从分析到制备的过程：案例,从分析到制备的过程：案例,纯化后的样品分析谱图,从分析到制备：5要素,1）制备的目的是在一次操作中尽 可能地多上样，所以，首先得 在分析柱上实现超载，否则， 分析柱分离得再漂亮，再在制 备柱
16、中线性放大时就因为成本 不合理而被无情地否决。 2）制备的目的是分离你所关心的组分，只要它能与其它杂质分离的好就行了，所以不要希望在分析柱上先得到所有组分的基线分离，完全没有必要！ 3）制备中常常因为超载而无法使目的物与邻近杂质间达到基线分离，可以采用分段收集的方法得到指定纯度的目的物，要求越纯，单次操作的得率也越低。 4）制备中因为目的物来之不易，常常需要将纯度不合格的目的物重新上柱循环。由于重新上柱是会增加成本的，所以超载的量要平衡单次操作的纯品得量和效益与返工成本，以单位纯品数量进行成本核算，以优化最佳上样量。,Thank you and your ideas!,联系方式：张浩 13466633087 ,
