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1、生物工程专业核心课程,基 因 工 程,华东理工大学 张惠展,基因工程,5,2,3,4,1,6,7,8,9,基因工程的基本概念,基因工程的基本原理,基因工程所需的基本条件,基因工程的操作过程,目的基因的克隆与基因文库的构建,大肠杆菌基因工程,酵母基因工程,哺乳动物基因工程,高等植物基因工程,D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策,6 大肠杆菌基因工程,C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略,B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理,A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征,E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素,A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征,6 大肠杆菌基因工程,大肠杆菌表达外源基因的优势,全基因组
2、测序，共有4405个开放型阅读框架,基因克隆表达系统成熟完善,繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定,被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物,A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征,6 大肠杆菌基因工程,大肠杆菌表达外源基因的劣势,缺乏对真核生物蛋白质的复性功能,缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统,内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白,细胞周质内含有种类繁多的内毒素,B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理,6 大肠杆菌基因工程,启动子,终止子,核糖体结合位点,密码子,质粒拷贝数,启动子,启动子最佳距离的探测,目的基因,E,E,A,启动子,A 酶切开,Bal31酶解,目的基因,启动子,启
3、动子的筛选,Apr,ori,galK,pKO1,终止密码子,采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段,克隆到启动子探针质粒pKO1上,受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质,粒上报告基因galk的表达产物联合作用，,可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质,转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株,含有外源启动子活性的重组克隆,启动子,启动子的构建,-35 区序列,-10 区序列,PlL,PrecA,Ptrp,Plac,PtraA,Ptac,启动子,T T G A C A,G A T A C T,T T G A T A,T A T A A T,T T G A C A,T T
4、A A C T,T A G A C A,T A A T G T,T T T A C A,T A T A A T,T T G A C A,T A T A A T,Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac,启动子,启动子的可控性,P,乳糖启动子Plac的可控性：,O,P,O,高效转录,阻遏蛋白,诱导,乳糖 异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）,野生型的Plac与其控制区Olac,偶联在一起，在没有诱导物,存在时，整个操纵子处于基,基底水平转录,底水平表达；诱导物可以使,启动子Plac介导的转录大幅,提高,启动子,启动子的可控性,Plac,乳糖启动子Plac的可控性：,O,Plac,O,高
5、效转录,葡萄糖代谢,野生型的Plac上游附近拥有,代谢激活因子（CAP）结合,区，cAMP激活CAP，CAP,基底水平转录,结合启动子控制区，进而促,进Plac介导的转录。葡萄糖,代谢使cAMP减少，也能阻,遏Plac介导的转录。因此，,基因工程中使用的乳糖启动,子均为抗葡萄糖代谢阻遏的,突变型，即Plac UV5,CAP,cAMP,cAMP浓度降低,Plac UV5,O,高效转录,启动子,启动子的可控性,Ptrp,色氨酸启动子Ptrp的可控性：,Otrp,除去色氨酸,色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏,蛋白复合物的阻遏，转录呈基底,状态。在培养系统中去除色氨酸,基底水平转录,或者加入3-吲哚
6、丙烯酸（IAA），,便可有效地解除阻遏抑制作用。,在正常的细菌培养体系中，除去,色氨酸是困难的，因此基因工程,中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目,基因的表达,色氨酸,或加3-吲哚丙烯酸,高效转录,阻遏蛋白,（IAA）,Otrp,Ptrp,高效转录,Otrp,Ptrp,启动子,启动子的可控性,l噬菌体启动子PlL的可控性：,噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白阻,遏，很难直接诱导控制。在基因,工程中常使用温度敏感型的cI突,变基因cI857控制PL。 cI857阻遏蛋,在42时失活脱落，PL便可介导,目的基因的表达。但在大型细菌,培养罐中迅速升温非常困难，因,此常使用一个双质粒控制系统，,用色氨酸间
7、接控制目的基因表达,Ptrp,A,B,cI857,PL,目的基因,阻遏作用,Ptrp,A,B,PL,表达,色氨酸,终止子,强化转录终止的必要性,外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物 过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，
8、甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率,终止子,强终止子的选择与使用,目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用 终止子也可以象启动子那样，通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选,pCP1,Apr,ori,Tcr,筛选Apr、Tcs的转化子,核糖体结合位点,外源基因在大肠
9、杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）,核糖体结合位点,大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5 UAAGGAGG 3，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3端区域3 AUUCCUCC 5并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始
10、密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子； SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成； 基因编码区5 端若干密码子的碱基序列,核糖体结合位点的结构,核糖体结合位点,核糖体结合位点对外源基因表达的影响,SD序列的影响：,一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低,核糖体结合位点,核糖体结合位点对外源基因表达的影响,SD序列与起始密
11、码子之间的序列的影响：,SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍,核糖体结合位点,核糖体结合位点对外源基因表达的影响,SD序列与起始密码子之间的距离的影响：,SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AU
12、G之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低,核糖体结合位点,核糖体结合位点对外源基因表达的影响,起始密码子及其后续若干密码子的影响：,大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50%而UUG只及AUG的25%。除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5 端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位 目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最
13、佳的,密码子,生物体对密码子的偏爱性,不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码,子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：,生物基因组中的碱基含量 在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体,fX174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高；而在GC,丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子,占90%以上的绝对优势,密码子与反密码子相互作用的自由能 性中等强度规律,细胞内tRNA的含量,如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少；,如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；,密码子
14、,密码子偏爱性对外源基因表达的影响,由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程,大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高,效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略,可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：,外源基因全合成,同步表达相关tRNA编码基因,密码子,密码子偏爱性对外源基因表达的影响,按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法,外源基因全合成,密码子,密码子偏爱性对外源基因表达的影响,对于那些含有不和谐密码子种类单一、
15、出现频率较高、而本身分子量又较大的外源基因而言，则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达的策略较为有利。例如，在人尿激酶原cDNA的412个密码子中，共含有22个精氨酸密码子，其中7个AGG、2个AGA，而大肠杆菌受体细胞中tRNAAGG和tRNAAGA的丰度较低。为了提高人尿激酶原cDNA在大肠杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另一个高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体细胞对外源基因高效表达的制约作用,同步表达相关tRNA编码基因,质粒拷贝数,质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响,目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷
16、贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降 解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道,质粒拷贝数,质粒扩增时序的控制,pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子,pCP3,PL,MCS,ori,Apr,在28时，每个细胞的质粒拷贝数为60,在42时，拷贝数迅速增至300 - 600,在此温度下，受体细胞染色体上的CI基,因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活,因此，用一种手段同时控制质粒拷,贝数和基因的表达,C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略,6 大肠杆菌基因工程,包涵体型异源蛋白
