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1、基因工程的优点,第二章 基因工程,原核生物与真核生物、动物与植物的遗传信息进行相互重组和转移,打破物种界限,可实现,基因工程研究的理论依据,2）基因是可切割,1）不同基因具有相同的遗传物质,3）基因是可以转移,4）多肽与基因之间存在对应关系,5）遗传密码是通用的,6）基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代,第一节 DNA重组,一、DNA,1、核酸的组成与结构,DNA是一类由四种脱氧核苷酸（A、T、G、C）聚合而成的大分子,核苷酸分子由戊糖、磷酸和碱基组成。,（1）核酸的组成,碱基,核糖,核苷,核苷酸,（2）DNA的结构,单链DNA,双链DNA,（1）DNA分子能在细胞内复制,2、DNA的功能,
2、（2）携带遗传信息,DNA分子上只有编码基因的片段才能转录合成相应的RNA（mRNA、rRNA、tRNA）。,1）DNA分子转录合成RNA,mRNA,T,U,tRNA,核糖体RNA (rRNA),原核生物,原核生物,2）mRNA翻译合成蛋白质,缬,酪,色,二、 限制性内切核酸酶和DNA片段化,基因工程的关键技术是DNA的连接、重组，但是DNA在连接之前必须进行加工，把DNA分子切割成所需要的片段。,在合适条件下，使每条DNA的一个磷酸二酯键断开，,1、限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）,一类以环状或线形双链DNA为底物，,能识别DNA中的特定核苷酸序列，,产生
3、3-OH和3-P基团DNA片段,的脱氧核酸内切酶(endodeoxyribonuclease)。,III型酶：识别和切割相差限定数核苷酸。,分为I、II、III型酶。基因工程中使用的为酶。,限制性内切酶,I型酶：先识别，移动后在切割。,II型酶：识别处切割DNA。,限制性内切酶在DNA 分子上能识别的特定核苷酸序列,3CTTAAG5,2、限制性核酸内切酶的识别序列,识别序列(识别位点),如：,EcoR I的识别序列为,5GAATTC3,不同限制性内切酶产生DNA片段大小,型限制性内切酶的切割位点处在识别序列内,3、限制性核酸内切酶的酶切位点,同裂酶（isoschizomer）,有一些限制性内切
4、酶虽来源不同，但有相同的识别序列。,BamH I和Bs I具有相同识别序列,如：,5GGATCC3,3CCTAGG5,两条链断裂的位置处在识别序列的对称结构中心，产生的DNA末端是平齐的。,两条链断裂呈交错对称，产生的DNA末端的一条链多出几个核苷酸，成为凸出末端。,粘性末端（sticky end）,平齐末端（blunt end）,限制性内切虽然识别序列不同，但切割DNA片段具有相同的粘性末端。,BamH I的识别序列GGATCC,同尾酶（isocaudamer）,Bcl I的识别序列TGATCA,如：,4、限制性内切核酸酶反应系统,底物（环状或线状双链DNA）,缓冲液,温度（37）,3）部分
5、酶切,5、限制性内切核酸酶酶切DNA的方法,1）单酶切,2）双酶切,三、特异性DNA片段的PCR扩增,DNA聚合催化（70-75）使引物延伸。,1、PCR原理,PCR包括3个反应,双链DNA变性成单链,复性（36-60）,引物同单链DNA互补序列结合,变性（90-95）,延伸（70-75）,如此经过25-40次循环。,以单链或双链DNA为模板,2、DNA聚合酶(polymerase),一种催化由脱氧核糖核苷酸合成DNA的酶,称为依赖DNA的DNA聚合酶,DNA聚合酶催化合成DNA互补链的条件,四种脱氧核苷5-三磷酸,带有3-OH游离基团的引物链,DNA摸板，双链DNA只有在糖-磷主链上有缺口时
6、，才是有效的摸板。,最大特点：耐高温。,Taq DNA聚合酶,一种耐热的依赖DNA的DNA聚合酶,具53聚合酶活性,具53外切酶活性,通过切口平移标记DNA分子，测序。,DNA聚合酶,大肠杆菌PolA基因编码的一种单链DNA聚合酶,Pol有三种不同的酶活性,53的聚合酶活性,53的核酸外切酶活性,3 5的核酸外切酶活性,DNA聚合酶的主要用途,修补经限制酶消化的DNA所形成的3隐蔽末端，标记DNA末端，cDNA克隆中第二链的合成，DNA序列测定。,大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段,又叫Klenow聚合酶或Klenow大片段酶,是由大肠杆菌DNA聚合酶全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段
7、分子。,Klenow聚合酶的功能,53的聚合酶活性,3 5的核酸外切酶活性,Klenow聚合酶的主要用途,T4DNA聚合酶,T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种特殊的DNA 聚合酶,具53的聚合酶活性,3 5的核酸外切酶活性,用途,标记探针DNA片段，DNA测序。,合成的长度比其他聚合酶要长,T7噬菌体DNA聚合酶,来源T7噬菌体感染的大肠杆菌,持续合成最强的DNA聚合酶,逆转录酶（Reverse transcriptase）,主要作用,一类依赖于RNA的DNA聚合酶,以RNA为模板,催化脱氧-5-三磷酸合成DNA,具有Rnase H活性,将mRNA反转录成cDNA,3、PCR引物,5
8、,3,5,3,能够引导模板DNA互补链合成的寡聚核苷酸,3-OH,15-30个核苷酸,GC含量40-60%,浓度一般为0.1-0.5mol/L,4、DNA片段扩增系统,P4,P3,P1,P2,巢式/套式PCR （Nested polymerase chain reaction）,再用另一对引物扩增第一对引物扩增的产物,第一次扩增所用引物,第二次扩增作用的引物,先用一对引物对模板进行扩增,因为同两套引物都互补的靶序列很少降低了扩增多个靶位点的可能性,外引物,内引物,主要用于极少量的模板的扩增,优点,用途,反向PCR（reverse PCR）,扩增引物与PCR序列方向相反,主要用于已知序列两翼未知
9、DNA序列的扩增,不对称PCR（asymmetric PCR）,两种引物比例相差较大的PCR,用于制备核酸序列分析的单链DNA片段或核酸杂交的探针,在一通用引物反转录的cDNA3端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行PCR。,锚定PCR,可用于未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建,降解源自脱嘌呤作用，即DNA分子中碱基和戊糖间的氮糖苷键发生水解。,长程PCR,长程PCR系统可扩增20kb以上的片段,在一般条件下，难以扩增大于5kb的DNA片段,主要原因,扩增大片段时标准缓冲液在高温下不能保持正常的pH值，从而导致模板DNA降解，,由于Taq酶只能以DNA为模板，
10、当待扩增模板为RNA时，需先将其反转录为cDNA才能进行PCR扩增,反转录PCR（reverse transcription PCR）,在同一反应中用多组引物同时扩增几种基本片段,多重PCR（multiple PCR),直接对载玻片上细胞涂片或组织切片进行PCR扩增,原位涂片PCR,定量PCR（real-time PCR）,PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。,通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量,荧光定量PCR技术,荧光探针:荧光发射基团和一个荧光淬
11、灭基团。,为达到某些特殊应用目的如定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析等，可在引物的5端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析物结合位点等,修饰引物PCR,四、DNA片段的化学合成,1、合成引物,2、合成DNA寡聚合核苷酸连杆（linker）,也称为衔接物或接头,3、合成基因片段,最适温度37,五、DNA片段的连接重组,1、DNA连接酶（ligase）,能够催化两个DNA片段末端之间的-P基团和-OH基团形成磷酸二酯键的酶,DNA连接酶反应温度,一般采用16-20 。,由大肠菌DNA编码的DNA 连接酶,大肠菌DNA 连接酶,也能连接用不同内切酶切割产生的平齐末端,只能连接具互补粘性末
12、端的DNA片段,T4噬菌体DNA连接酶,由T4噬菌体DNA编码的DNA 连接酶,既能连接具互补粘性末端的DNA片段,2、DNA片段之间的连接,（1）粘性末端DNA片段的连接,直接连接,转化成平齐末端再连接,使DNA平齐末端的3-OH加上同聚核苷酸，产生具有poly(A) 、 poly(T) 、poly(G) 、poly(C)的粘性末端。,（2） DNA末端修饰后的连接,1）DNA片段末端修饰酶,末端脱氧苷酸转移酶,简称为末端转移酶,可以切去DNA片段的凸出末端，成为平齐末端。,核酸外切酶,（terminal deoxynucleotidyl transferase）,催化核酸分子脱掉5 P基团
13、,转换成为5 OH的酶。,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase ）,使DNA或RNA的去磷酸化，防止DNA的自身环化。,主要作用,若同聚物不等长，需用DNA聚合酶或Klenow大片段酶填补。再用DNA连接酶连接。,同聚物加尾法（homopolymer tailing）,2）DNA末端修饰后的连接,衔接物连接法,用化学方法合成的一段由10-12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链DNA寡聚核苷酸片段。,衔接物（linker）,接头连接法,接头（adaptor）,能够携带外源基因进入受体细胞的DNA分子。,承载外源DNA片段的载体进入细胞后，以便筛选克隆子。,第
14、二节 基因克隆载体,载体（vector）,（1）多克隆位点（ MCS，multiple cloning site）,基因克隆载体必备条件,（2）复制原点(ORI, origin ),（4）安全,能使外源DNA片段插入,能进行自我复制,（3）选择标记基因,一、质粒载体,质粒（plasmid）,染色体外能自我复制的双链闭合环DNA分子，,广泛存在于细菌细胞中,松弛型复制质粒,在寄主细胞内，能复制几百上千个拷贝。,严紧型复制质粒,在寄主细胞内，只能复制少数几个拷贝。,外源基因插入的多克隆位点（MCS）,构建质粒载体,一般选用分子小的松弛型复制质粒,应具有复制起始点（ori），能够在受体细胞内复制。,
15、此外，质粒还有1-2个选择标记基因（Ampr、 Kanr 、Cmr、Tetr、Lac Z ）,BR分别为Boliver & Rodrigue首字母缩写,1 、大肠杆菌质粒载体,（1）pBR322质粒,p表示质粒,氨苄青霉素（Ampr，Tn3 ）,pMB1 （类似 Col E1质粒，具大肠杆菌素E1合成酶基因）,四环素抗性（Tetr，pSC101 ）基因,复制原点,选择标记基因,多克隆位点（multiple cloning site）,TcR内有11个限制性内切酶位点，其启动子内2个,64个限制性内切酶位点,ApR内有6个限制性内切酶位点,大肠杆菌-半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及编码-半乳
16、糖苷酶 -肽链的DNA序列(lacZ基因),（2）pUC质粒载体,Messing & Vieria （University of California）1987年构建,pBR322质粒的复制起点（ori）,氨苄青霉素抗性基因（ampr）,lacZ 内有13个酶切位点的多克隆位点。,pUC18,pUC19,X-Gal is a noninducing chromogenic substrate for beta-galactosidase, which hydrolyzes X-Gal forming an intense blue precipitate. X-GaI is most frequently used in conjunction with IPTG in blue/white colony
