{生物科技管理}生物化学仪器分析紫外

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1、下午3时57分,1,第3章 紫外光谱 Ultraviolet Spectrometry, UV,主讲：孙立权,2020年8月3日星期一,2,2020年8月3日星期一,3,3.1 紫外吸收光谱分析基本原理 Principles of UV 3.1.1紫外吸收光谱的产生 3.1.2有机物紫外吸收光谱 3.1.3有机物紫外吸收光谱 3.1.4蛋白紫外吸收光谱 3.1.5核酸紫外吸收光谱 3.1.6紫外吸收光谱影响因素 3.1.7 显色反应,2020年8月3日星期一,4,3.1 紫外吸收光谱分析基本原理Principles of UV,3.1.1 紫外吸收光谱的产生Formation of UV 1.

2、概述 基于物质对紫外光选择性吸收的分析方法。,2020年8月3日星期一,5,2.物质对光的选择性吸收及吸收曲线,M + 热,M + 荧光或磷光,E = E2 - E1 = h 量子化 ；选择性吸收定性依据。,M + h M * 基态 激发态 E1 （E） E2,2020年8月3日星期一,6,可见紫外波长范围：100-800 nm. (1) 远紫外光区: 100-200nm (2) 近紫外光区: 200-400nm (3)可见光区:400-800nm,3.1.1 紫外吸收光谱的产生Formation of UV,2020年8月3日星期一,7,可见光谱与紫外光谱的共同之处 光谱法：可用于结构鉴定、

3、定性和定量分析； 定性依据：特征吸收； 定量依据：朗伯比耳定律； 能级跃迁：分子中价电子能级跃迁； 光谱形状：电子跃迁的同时，伴随着振动、转动能级的跃迁带状光谱。,3.1.1 紫外吸收光谱的产生Formation of UV,2020年8月3日星期一,8,可见光谱与紫外光谱的共同之处 吸收曲线（A-曲线） 吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。 关于吸收曲线的讨论与可见光谱相同,3.1.1 紫外吸收光谱的产生Formation of UV,2020年8月3日星期一,9,3.电子跃迁与分子吸收光谱 物质分子内部三种运动形式： （1）电子相对于原子核的运动； （2）原子核在其平衡位置附近的

4、相对振动； （3）分子本身绕其重心的转动。,3.1.1 紫外吸收光谱的产生Formation of UV,2020年8月3日星期一,10,分子具有三种不同能级：电子能级、振动能级和转动能级 三种能级都是量子化的，且各自具有相应的能量。 分子的内能：电子能量Ee 、振动能量Ev 、转动能量Er 即e+v+r evr,3.电子跃迁与分子吸收光谱,2020年8月3日星期一,11,能级跃迁 电子能级间跃迁的同时，总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。,3.电子跃迁与分子吸收光谱,2020年8月3日星期一,12,讨 论,转动能级间的能量差

5、r：0.0050.050eV，跃迁产生吸收光谱位于远红外区。远红外光谱或分子转动光谱； 振动能级的能量差v约为：0.05eV，跃迁产生的吸收光谱位于红外区，红外光谱或分子振动光谱； 电子能级的能量差e较大120eV。电子跃迁产生的吸收光谱在紫外可见光区，紫外可见光谱或分子的电子光谱。,2020年8月3日星期一,13,讨 论,吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级间的能量差所决定，反映了分子内部能级分布状况，是物质定性的依据。 吸收谱带的强度与分子偶极矩变化、跃迁几率有关，也提供分子结构的信息。通常将在最大吸收波长处测得的摩尔吸光系数max也作为定性的依据。不同物质的max有时可能相同，但ma

6、x不一定相同； 吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比，定量分析的依据。,2020年8月3日星期一,14,1有机化合物电子类型及电子跃迁类型 三种价电子：电子、电子、n/p电子； 电子跃迁类型：n； n； 。,3.1.2 有机物紫外吸收光谱 Ultraviolet spectrometry of organic compounds,2020年8月3日星期一,15,分子轨道理论：成键轨道反键轨道。 当外层电子吸收紫外或可见辐射后，就从基态向激发态(反键轨道)跃迁。 主要有四种跃迁，所需能量大小顺序为：n n ,3.1.2 有机物紫外吸收光谱 Ultraviolet spectrometry

7、of organic compounds,2020年8月3日星期一,16,2跃迁,所需能量最大；电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁； 饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区； 吸收波长200 nm； 例：甲烷的max为125nm , 乙烷max为135nm。 只能被真空紫外分光光度计检测到； 作为溶剂使用。,2020年8月3日星期一,17,3n 跃迁,所需能量较大。 吸收波长为150250nm，大部分在远紫外区，近紫外区仍不易观察到。末端吸收。 含非键电子的饱和烃衍生物(含N、O、S和卤素等杂原子)均呈现n跃迁。,2020年8月3日星期一,18,4 跃迁,所需能量较小，吸收波长处于远紫外区的

8、近紫外端或近紫外区，max一般在104Lmol1cm1以上，属于强吸收。 （1） 不饱和烃*跃迁 乙烯*跃迁的max为165nm,max为: 1104 Lmol-1cm-1。 K带共轭非封闭体系的*跃迁,C=C 发色基团， 但 *200nm。,max=165nm 助色基团取代 * (K带)发生红移,（2）共轭烯烃中的 *,2020年8月3日星期一,20,5 n跃迁,含杂原子的双键化合物，或者当有杂原子上的孤对电子与碳原子上的*轨道，则可产生n *跃迁吸收。 200400nm。 禁阻跃迁，吸收强度很弱，102 Lmol-1cm-1 。 同时存在*跃迁。 丙酮*跃迁（K带）：max=194nm，

9、max=9103Lmol-1cm-1 ； 丙酮n *跃迁（R带）： max=280nm， max=22Lmol-1cm-1 (溶剂环己烷)。,饱合有机化合物的电子跃迁类型为*，n* 跃迁，吸收峰一般出现在真空紫外区，吸收峰低于200nm，实际应用价值不大。 不饱合机化合物的电子跃迁类型为n*，* 跃迁，吸收峰一般大于200nm。,2020年8月3日星期一,22,6. 生色团与助色团,最有用的紫外光谱是由*和n *跃迁产生。 这两种跃迁均要求有机物分子中含有不饱和基团。 生色团：是指分子中可以吸收光子而产生电子跃迁的原子基团。能产生紫外-可见吸收、含有键的不饱和基团称。简单的生色团由双键或叁键体

10、系组成，如乙烯基C=C 、羰基C=O 、亚硝基N=O 、偶氮基NN、乙炔基、腈基CN等。（chromophore）,2020年8月3日星期一,23,6. 生色团与助色团,助色团：一些含有n电子的基团(如-OH、-OR、-NH、-NHR、-X等)，它们本身没有生色功能(不能吸收200nm的光)，但当它们与生色团相连时，就会发生n共轭作用，增强生色团的生色能力(吸收波长向长波方向移动，且吸收强度增加)，这样的基团称为助色团。 (auxochrome),2020年8月3日星期一,24,7. 红移与蓝移,红移:max向长波方向移动。 蓝移 (或紫移):max向短波方向移动。 增色效应或减色效应:吸收强

11、度即摩尔吸光系数增大或减小的现象分别称为。,有机化合物的吸收谱带常常因引入取代基或改变溶剂使最大吸收波长max和吸收强度发生变化。,9. 有机化合物的吸收带,吸收带(absorption band): 在紫外光谱中，吸收峰在光谱中的波带位置。根据电子及分子轨道的种类，可将吸收带分为四种类型。,R吸收带 K吸收带 B吸收带 E吸收带,2020年8月3日星期一,26,吸收带及吸收带类型,吸收峰对应的波长位置称为吸收带。,R吸收带：由于发生n跃迁而产生的吸收带。 n为禁阻跃迁，跃迁几率很小； 一般地，R吸收带的270nm，100； 当使用极性溶剂时， R吸收带发生蓝移。,2020年8月3日星期一,2

12、7,吸收带及吸收带类型,K吸收带：由*跃迁而产生的吸收带。 发生在共轭烯炔分子； 吸收很强，104； 波长位置小于R 吸收带。,非极性 极性 n *跃迁：兰移； ； *跃迁：红移； ；,2020年8月3日星期一,28,吸收带及吸收带类型,B吸收带：位于278nm的吸收带。 由苯环的*跃迁引起； 吸收较强， =1100 ； 在非极性溶剂中测定时有精细结构，而在极性溶剂中精细结构消失。,当芳环与发色团直接相连时会同时出现K、B 两带(B 带波长较长)，且B 带产生红移。若分子中含有n 电子，还会有R 带同时出现。,2020年8月3日星期一,29,吸收带及吸收带类型,E吸收带：在一定意义上，苯环可看

13、成三个共轭的乙烯组成。 苯环中的这种乙烯键和共轭乙烯键引起的紫外吸收带分别称为E1 和E2 带。,四种吸收带按能量高低排列：一般有E1E2KBR,2020年8月3日星期一,30,10. 吸收波长的计算,非共轭体系：饱和烷烃；有助色团取代的衍生物；孤立发色团。 共轭体系：共轭烯烃。,基-是由非环或六环共轭二烯母体决定的基准值； 无环、非稠环二烯母体： max=217 nm,a.共轭烯烃中的 *,异环（稠环）二烯母体： max=217 nm 同环（非稠环或稠环）二烯母体： max=253 nm niI : 由双键上取代基种类和个数决定的校正项,(1)每增加一个共轭双键 +30 (2)环外双键 +5

14、 (3)双键上取代基：,酰基（-OCOR） 0 卤素（-Cl，-Br） +5 烷基（-R） +5 烷氧基（-OR） +6,2020年8月3日星期一,33,217,227,2020年8月3日星期一,34,2020年8月3日星期一,35,b.羰基化合物共轭烯烃中的 *, Y=H,R n * 180-190nm * 150-160nm n * 275-295nm Y= -NH2,-OH,-OR 等助色基团,K 带红移，R 带兰移； R带max =205nm ；10-100,不饱和醛酮 K带红移：165250nm R 带红移：290310nm,2020年8月3日星期一,36,c. , -不饱和羧酸及其

15、酯 *跃迁K 带红移程度小于 ,-不饱和酮, max约200240nm，104。,由于存在这种共轭，羰基的亲电子性降低，即接受C=C上电子，形成 *跃迁的能力降低，使 ,-不饱和酸及酯发生 *跃迁需要较大的能量， max蓝移。,2020年8月3日星期一,37,d. 芳香烃及其杂环化合物,苯： E1带180184nm； =47000 E2带200204 nm =7000 苯环上三个共轭双键的 *跃迁特征吸收带； B带230-270 nm =200 *与苯环振动引起； 含取代基时， B带简化，红移。,2020年8月3日星期一,38,乙酰苯紫外光谱图,羰基双键与苯环共轭： K带强；苯的E2带与K带合

16、并，红移； 取代基使B带简化； 氧上的孤对电子： R带，跃迁禁阻，弱；,2020年8月3日星期一,39,苯环上助色基团对吸收带的影响,2020年8月3日星期一,40,苯环上发色基团对吸收带的影响,. 立体结构和互变结构的影响,顺反异构： 顺式：max=280nm； max=10500 反式：max=295.5 nm；max=29000,互变异构： 酮 式：max=204 nm 烯醇式：max=243 nm,2020年8月3日星期一,42,立体结构和互变结构的影响,. 溶剂的影响,非极性 极性 n *跃迁：兰移； ； *跃迁：红移； ；,极性溶剂使精细结构消失,. 溶剂的影响,n *跃迁：兰移； ；, *跃迁：红移； ；,2020年8月3日星期一,45,3.1.3 无机化合物紫外可见吸收光谱,1. 电荷迁移跃迁 (1)配合物的电荷迁移跃迁 配合物分子吸收光辐射后，分子中的电子由配体的轨道跃迁到与中心离子相关的轨道上