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1、宜春学院化学与生物工程学院毕业设计（论文）嗜热微生物的研究进展及应用宜春学院 化学与生物工程学院 03生物教育 张志刚指导老师：姜琼摘要 嗜热微生物是一类最适生长温度高于45C的微生物，嗜热酶是从嗜热微生物中分离得到的一类热稳定性酶，由于嗜热酶分子内部有很多氢键、二硫键及紧密而有韧性的空间结构的存在，所以嗜热酶在高温条件下具有很强的稳定性，高温反应活性，以及对有机溶剂、去污剂和变性剂的较强抗性，嗜热酶在许多方面都有广泛的应用。当前获得嗜热酶的方法主要有：直接从嗜热微生物中提取、利用基因工程技术在中温宿主中表达和利用定向分子进化技术筛选。目前酶的纯化主要采用层析法、高效液相色谱法和电泳法等方法。
2、由于环境恶化,能源危机,全球变暖等原因, 嗜热酶的开发和应用将出现更加诱人的前景。 关键词 嗜热微生物；嗜热酶；嗜热机制；应用Thermophilic microorganism research progress and applicationZhang Zhigang College of Chemistry and Bioengineering, Bioengineering (Biology education), YiChun University Advisor: Jiang QiongAbstract Thermophilic microorganisms is a type o
3、f microorganisms that the most suitable growth temperature is above 45C,the thermophilic enzyme is a type of a thermostable enzyme separated from the thermophilic microorganism, because there is a lot of hydrogen keys and two-sulphur keys in the thermophilic enzyme molecule, so the thermophilic enzy
4、me have a very strong stability in the hot condition, as well as there is a stronger fastness to organic solvent、 eradicator and denaturant,the thermophilic enzyme have an extensive application in many fields.The method which obtained the thermophilic enzyme includes three kinds at present: distille
5、d directly from the thermophilic microorganism, expressed in the mild host making use of a genetic engineering technique and sieved with the directional molecule evolution technique. At present the enzyme purification methods are:chromatography、HPLC and electrophoresis. Due to the cause of worsening
6、 environment, energy crisis,warmer weather, the development and application of the thermophilic enzyme will appear more captivating foreground.Keywords Thermophilic microorganisms; Thermophilic enzyme; Thermophilic mechanism; Application最适生长温度高于45C的微生物称为嗜热微生物，是在高温环境下生存的一类微生物，它们有其自己的适应机制和特定的新陈代谢能力，具有
7、独特的基因类型、特殊的生理机制及代谢产物，是地球上的边缘生命形式。嗜热酶是从嗜热微生物中分离得到的一类热稳定性酶，具有化学催化剂无法比拟的优点，尤其是在高温条件下保持极好的稳定性，使很多高温化学反应得以实现从而将极大的促进生物技术产业的发展。近年来，人们已从嗜热微生物中分离得到多种嗜热酶。今后，还应继续在嗜热酶的结构与功能、应用等方面作深入而全面的研究。本文主要对嗜热酶的研究进展及应用作一综述。1 嗜热微生物的分类及其酶的种类和特点1.1 嗜热微生物的分类嗜热微生物是一类生长温度跨度在40150之间的微生物,它可分为轻度嗜热(最适生长温度低于60)、中度嗜热(最适生长温度低于85) 和极度嗜热
8、(最适生长温度大于85) ,主要分布于地热环境(海底温泉和陆地温泉) 和其它高温环境(如堆肥、厩肥、高温水处理厂)1。见诸报道的能产嗜热蛋白酶的嗜热微生物中,以芽孢杆菌最多。例如, Bacillus sp.MO21,B.sp.EA.1,B.thermoproteolyticus ,B . licheniformis及B.circulans,B.sp.AK1,B.sp.B18,B.smithii,B.sp.BT1,B.sp.wai 21a,B.pumilus MK65,B.sp.JB299.此外,在真菌、古细菌、放线菌中也有过报道2。1.2 嗜热酶的种类嗜热酶有许多种，各种酶的作用各不相同，目前
9、已开发的嗜热酶有：1）降解淀粉类的嗜热酶：极端耐热淀粉酶、热稳定的葡萄糖糖化酶(1,4-glucanohydrolase)、热稳定的支链淀粉酶(pullulanase)、热稳定的环糊精糖基转移酶(cycodextrin glycosytransferases,CGTase)；2）降解纤维素类物质的嗜热酶：热稳定性纤维素酶；3）热稳定的木聚糖酶(xylanases)；4）降解几丁质的热稳定性酶：热稳定的几丁质酶；5）降解蛋白质的热稳定性酶：热稳定的蛋白酶；6）葡萄糖异构酶(glucose isomersae)和木糖异构酶(xylose isomersae)；7）DNA聚合酶等3。1.3 嗜热酶的
10、特点嗜热酶是一类主要来源于嗜热微生物的热稳定酶,能够在高温下长时间保持活性而不变性,其特点可概括为三点：1）作用的最佳温度高 嗜热酶作用最佳温度大多数在6080 之间,但也有少数例外。例如,来自Bacillus sp. B18的嗜热蛋白酶,其作用最佳温度为854；来自Thermoplasma acidophilum的嗜热蛋白酶,其作用最佳温度为955。最值得一提的是,来自Pseudomonas sp.的嗜热蛋白酶,其作用最佳温度为1206。2）具有良好的耐热性 例如,由Bacillus sp.AK1产生的proteinase AKl在60、70时酶活性无变化,90时酶活性半衰期为19min7；
11、由Thermoactinomyces sp. E79产生的嗜热蛋白酶在90时,酶活半衰期为10min8；由Thermus sp. Rt41A产生的嗜热蛋白酶在70时酶活半衰期为24h9。3）具有良好的PH和热稳定性 例如,由Thermoactinomyces sp. E79产生的嗜热蛋白酶,在pH5.012.0范围内,酶活相当稳定8；由Bacillus sp. B18产生的嗜热蛋白酶在pH5.012.0范围内,酶活也相当稳定4；Bacillus stearothermophilus HY269产生的嗜热蛋白酶在70、80时,pH稳定范围分别为pH6. 010.0、pH6.08.010。2 嗜热
12、酶的热稳定机制嗜热酶的耐热性主要是由其分子内部结构决定的。维持嗜热酶内部立体结构的化学键，主要是氢键、二硫键的存在及数量与其热稳定性有关。一般认为，当这些键存在及数量增加时，酶的热稳定性增强；这些键断开，则酶的热稳定性降低或丧失。嗜热酶分子的许多微妙构造很可能与其稳定性有关。这些包括：稍长的螺旋结构，三股链组成的-折叠结构，C和N端氨基酸残基间的离子作用以及较小的表面环等。这些构造形成了嗜热酶紧密而有韧性的空间结构，从而提高其稳定性。酶蛋白为适应热环境会发生结构改变，但每一种酶的热适应机制不尽相同。一些酶在高温条件下结构发生了重排，使一些空间短距离基团相互作用，堆积的结构更优化，内部空洞的数量
13、和体积减少，在分子内部形成了一个疏水作用很强的疏水核，同时分子外部的极性表面积增加，所有这些都有利于增强嗜热酶的稳定性11。3 嗜热酶的获得3.1 直接从嗜热微生物中提取 从嗜热微生物的生境即堆肥、培养料、木屑堆、木片堆、树木、土壤、空气、动物巢穴、动物粪便、动物身体、昆虫等及火山口、沙漠、发热电器和电缆等特殊高温环境中分离嗜热微生物，然后直接从嗜热微生物中提取出嗜热酶。3.2利用基因工程技术在中温宿主中表达将嗜热微生物中的目的基因利用基因工程技术在中温宿主中成功表达，可在温和培养条件下得到大量的嗜热酶，从而克服因嗜热微生物生长速度较慢、培养条件严格而难以获得大量嗜热微生物的困难。目前，一些从
14、嗜热微生物中获得的基因已在大肠杆菌等中温宿主中得到了成功的表达12。3.3利用定向分子进化技术筛选将克隆的某一基因经体外诱变和重组获得大量突变体，经中温宿主表达后，再筛选得到在高温条件下有催化活力的突变体，着种定向分子进化技术是获得嗜热酶的一种新的途径。4 嗜热酶的纯化目前酶的纯化主要采用层析法：4.1 离子交换层析。离子交换层析是根据不同蛋白质与离子交换剂结合力不同而分离蛋白质。利用此方法能有效纯化嗜热酶。例如,孙超等10用CM-纤维素层析柱分离嗜热脂肪芽孢杆菌HY269的耐热金属蛋白酶获得成功。4.2 亲和层析。亲和层析法是纯化质的一种极为有效方法,它通常只需一步处理即可达到纯化目的。它是
15、根据蛋白质与相应配基亲和力大小不同而分离蛋白质,即目的蛋白因具有较强亲和力而留在层析柱上,非目的蛋白因亲和力小而被洗脱下来。例如,金城等13利用Cbz-L-Phe-T-Sepharose 4B亲和层析柱从嗜热脂肪芽孢杆菌HY269中分离纯化耐热金属蛋白酶。4.3 凝胶过滤层析。它是根据蛋白质分子大小不同而分离蛋白质。这也是一种有效纯化嗜热酶的方法。例如,唐兵等14用Sephadex G50凝胶柱从嗜热脂肪芽孢杆菌WF146中纯化耐热中性蛋白酶。4.4 离子交换层析与凝胶过滤层析配合使用。在分离纯化的过程中,常常出现目的蛋白与非目的蛋白具有相同电荷性质或相同分子量。这就使得用一步离子交换层析或凝
16、胶层析变得无效。若两种方法结合,则能取得满意效果。例如,Kumar CG15用离子交换层析、凝胶过滤层析纯化嗜热碱性蛋白酶。纯化嗜热酶除了层析法,还有高效液相色谱法、电泳法。最值得一提的是:Manro GK等9利用基因工程技术构建融合蛋白的方法来帮助纯化嗜热酶。5 嗜热酶的应用利用嗜热酶作为生物催化剂有如下的优点:(1)酶制剂的制备成本降低。因为嗜热酶的稳定性高,因而可以在室温下分离提纯和包装运输,并且能长久地保持活性;(2)加快了动力学反应。随着反应温度的提高,分子运动速度加快,酶催化能力加强;(3)对反应器冷却系统的要求标准降低,因而减少了能耗。由于嗜热酶有耐高温的特性,所以生产中不需要复杂的冷却装置。一方面节省了开支,另一方面也降低
