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1、第四章 荧光分析法 一、分子荧光分析理论基础 (一)概述 处于分子基态单重态中的电子对(自旋方向相反)中一个电子被激发,跃迁至激发单重态轨道上,再从第一激发态最低振动能级返回基态的各振动能级时发射荧光。,S,T,分子基态 激发态,+ h (吸收辐射),- h,分子基态,荧光,第四章 荧光分析法 一、分子荧光分析理论基础 (一)概述 处于分子基态单重态中的电子对(自旋方向相反)中一个电子被激发,跃迁至激发单重态轨道上,再从第一激发态最低振动能级返回基态的各振动能级时发射荧光。,(二)激发光谱和荧光光谱 1激发光谱:固定某一发射光波长,测定该波长下的荧光发射强度随激发光波长变化的光谱,得到荧光激发
2、光谱。 2.荧光光谱:固定某一激发光波长,测定荧光发射强度随发射波长变化的光谱,得到荧光光谱。,荧光光谱的特点: 1、斯托克斯位移(stokes shift):与激发光谱相比,荧光光谱的波长总是出现在更长的波长处。 2、荧光发射光谱与激发波长无关。 3发光量子产率(F):定义为发光物质发射的光子数与吸收的激发光光子数之比。 F=发射的光子数/吸收的光子数。,(三)影响物质发光的因素 1分子结构与荧光 (1)共轭度大,发射波长红移,发光强度增加。 (2)刚性平面性结构分子荧光量子产率高。,联苯 芴,F=0.2 F=1.0,F=0.11 F=0.29,em=278nm em=321nm,2取代基的
3、影响 给电子基团(-OH、-NH2等)增加荧光强度。 吸电子基团(-COOH、-NO2等)降低荧光强度。 3溶剂的影响 溶剂极性越大,增加荧光强度。 4温度的影响 温度越高,降低荧光强度,(四)荧光定量关系式 稀溶液的荧光强度与浓度成正比: If =2.3 I0 lc 当入射光强度I0 和l 一定时, If = K c (K为常数),荧光分析法的特点:灵敏度高,发光参数多,可进行动力学分析,分析线性范围比吸收光谱法宽,选择性比吸收光谱法好。但荧光寿命约为10-8秒。,二、荧光分析在医学中的应用 痕量分析: If =2.3 I0 lc= K c 使用激光光源,荧光定量分析的灵敏度甚至可达10-1
4、4 mol/l。使用激光光源的荧光分析法又称激光诱导荧光。,DNA荧光发光探针: 荧光探针在发光分析中应用广泛。 DNA (生命遗传的重要物质)分子的定量分析和特异识别对基因组学、病毒学、分子生物学等相关学科的发展具有十分重要的意义。 但生物分子自身的荧光较弱,目前多采用荧光探针法检测。 荧光探针法较传统的同位素检测速度快,重复性好,用样量少,无辐射,在DNA 自动测序、抗体免疫分析、疾病诊断、抗癌药物分析等方面已得到广泛应用。 目前DNA 荧光探针的研究热点: (1)灵敏度(2)避免生物荧光背景的干扰,吖啶类荧光探针 吖啶类染料是应用最早的核酸荧光探针。 机理:通过嵌入或静电吸引与DNA 分
5、子结合,使DNA 的荧光大大增强。 吖啶的基本结构为二苯并吡啶,在水溶液中呈弱碱性。 1940 年,发现当吖啶橙与酸性物质连接或存在于酸性物质中时,其特征光谱会发生一定的变化,开始被用于生物体的染色。,吖啶橙可与DNA 或RNA 作用,与双链DNA结合后,荧光激发/发射波长为502/538nm。 为提高染料稳定性及荧光强度,大量的吖啶衍生物被合成。 1、10-羧甲基吖啶酯,其荧光及稳定性都有很大提高,同时含有的羧基活性基可与生物分子共价结合。 2、吖啶的络合物,会对DNA 序列特异识别,有望成为DNA 的转录抑制剂,控制核酸的表达。,荧光素类荧光探针 荧光素1 :1871 年由Von Baye
6、r 合成, 最大吸收/发射:492/571 nm (水中),量子产率0.92。由于荧光强度大,大量的荧光素衍生物被合成并用作荧光检测试剂:荧光素2、3、4是应用最广泛的荧光衍生试剂,用于病毒学、细胞学及免疫组织化学。如将荧光素共价连接到核酸、寡核苷酸、药物、蛋白质及其它分子来合成探针,可用于基因病毒的检测及表达。,分子取向测定: 通过荧光偏振的测定,可以获得分子取向等结构信息。 荧光偏振度:P=(Iz-Ix)/(Iz+Ix) Iz, Ix分别代表起偏器和检偏器方向相互垂直和平行时测得的荧光强度。 荧光体的偏振度与荧光体的转动速度成反比,荧光体越小,转动速度越快,其偏振度越小。 当小分子荧光体连接到大分子蛋白质或抗体后, 分子转动速度变慢,偏振度增大。荧光偏振可用于免疫检测。,