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1、SARS病毒灭活疫苗临床前研究技术要点等技术要求 2003精品文档SARS病毒灭活疫苗临床前研究技术要点等技术要求的通知状态:有效 发布日期:2003-08-19 生效日期: 2003-08-19发布部门:广东省药品监督管理局发布文号: 粤药监注2003240号各市药品监督管理局:现将国家食品药品监督管理局关于印发SARS病毒灭活疫苗临床前研究技术要点等技术要求的通知（国食药监注2003128号）转发给你们，请通知从事SARS防治药物研究开发的单位遵照执行。二三年八月十九日关于印发SARS病毒灭活疫苗临床前研究技术要点等技术要求的通知国食药监注2003128号各省、自治区、直辖市药品监督管理局
2、：为加强SARS诊断试剂、疫苗以及防治药物筛选研发工作的管理，规范技术研究及实验方法，确保研究结果真实可靠，我局组织制定了SARS病毒灭活疫苗临床前研究技术要点、细胞模型筛选抗SARS病毒药物试验技术要求、SARS诊断试剂生产研制技术要求及SARS病毒毒株资料登记表等技术要求，现予印发，请从事SARS防治药物研发的单位遵照执行，并就相关问题通知如下：一、从事SARS疫苗研究、诊断试剂研制和有关药物筛选等工作的单位，在执行相关技术要求的同时，必须严格按照科学技术部、卫生部、国家食品药品监督管理局和国家环境保护总局四部局联合颁发的关于印发传染性非典型肺炎病毒实验室暂行管理办法和传染性非典型肺炎病毒
3、的毒种保存、使用和感染动物模型的暂行管理办法的通知（国科发农社字2003129号）要求保存和使用SARS病毒毒株，任何单位不得擅自进行毒株的转让。因SARS病毒毒株保存或者使用不当引起严重后果者，将承担相应的法律责任。二、各药物研究开发单位应按照SARS病毒毒株资料登记表的要求整理有关毒株的详细资料，于2003年7月31日前报中国药品生物制品检定所（北京天坛西里2号，邮编100050；联系人：董关木；联系电话：010-67058428）。未按规定要求提交SARS病毒毒株资料的，国家食品药品监督管理局将不受理其研发制品的注册申报和审批。三、中国药品生物制品检定所接到各单位报送的SARS病毒毒株资
4、料后，应及时审核并将审核意见和进行药物研究用毒种的基本情况，书面报国家食品药品监督管理局。四、请各省、自治区、直辖市药品监督管理局尽快将本通知转发至辖区内从事SARS防治药物研究开发单位。特此通知附件：1SARS病毒灭活疫苗临床前研究技术要点2细胞模型筛选抗SARS病毒药物试验技术要求3SARS诊断试剂生产研制技术要求4SARS病毒毒株资料登记表（略）国家食品药品监督管理局二三年七月一日附件1：SARS病毒灭活疫苗临床前研究技术要点随着对非典型肺炎的病原学、流行病学、诊断和治疗等学科进行全面深入的研究，在各领域已取得重要进展，尤其是确定了SARS病毒为其病原体，已成功分离到多株SARS病毒，并
5、已验证其能在Vero细胞和2BS等细胞系中培养增殖，这为研制疫苗提供了基础和基本条件。但是由于SARS病毒的研究有待进一步深入，疫苗的研制尚存在很多的不确定因素。为使SARS病毒灭活疫苗的临床前研究工作科学规范，特制定SARS病毒灭活疫苗临床前研究考虑要点。一、毒种研究本疫苗所用的毒种须证明为SARS病毒，如该毒种分离自人体，须提供以下资料（一）病毒株名称及来源1名称2宿主情况：（1）病人姓名、年龄、性别、民族、家庭住址；（2）发病地点、发病日期；（3）收住入院日期、临床确诊日期、实验室确诊日期；（4）病人病程及病人转归：死亡、痊愈、是否有后遗症；（5）毒株分离原样本：咽试子、漱口液、痰液、血
6、液、粪便或尸解标本组织名称；（6）取样日期；（7）取样时病人的病期；（8）取样地点；（9）病人是否留有恢复期血清；如有：采血日期（病期）和血清量；鉴于人类咽试子、漱口液、痰液、粪便等样品难免污染其他外原因子，因此建议尽可能采用病人血液分离的病毒株。（二）毒株分离过程1用细胞分离病毒，须提供所用细胞名称、代次、来源和细胞无菌检测、外原因子检测等资料；鉴于VeroE6细胞的生物学特性，用VeroE6细胞分离的SARS病毒不能直接用于疫苗生产用毒种，须将VeroE6细胞的适应株重新转适应到Vero细胞或二倍体细胞株的毒种方能用于生产，因此建议尽可能使用直接以Vero细胞或二倍体细胞株分离的毒种。2通
7、过动物分离病毒，须提供所用动物名称、动物品系、动物级别、动物年龄和制备毒种的动物脏器名称等资料；如再适应到细胞，则还须提供1项中的6所述的细胞资料。（三）病毒分离传代特性样品处理方法、首次盲传确证病毒阳性代次、病毒确证检定方法、每代培养天数、病毒滴度、滴定方法、动物是否发病或死亡等资料。（四）毒种建立和保存原始毒种代次、毒种病毒滴度、毒种添加的保护剂的名称和浓度、毒种存储条件。毒种批的建立应按中国生物制品规程疫苗毒种要求进行，应建立原始毒种、主毒种和工作毒种批三级毒种库，主种子和工作种子批还须有毒种的限定代次的资料，以证明主种子和工作种子批在规定代次内的生物学特性与原始毒种一致。（五）毒种的检
8、定1毒种的鉴别试验：应提供检定方法、检定日期、检定结果等资料，建议采用下述方法进行鉴别试验：（1）可使用确诊为SARS病人的恢复期高效价血清中和病毒。（2）测定中和前后的病毒滴度。（3）应有病毒株的核酸全序列分析的资料，包括序列测定的方案、测定方法和测定结果，测定结果应附核酸序列图、推导的氨基酸序列图、种系发生树图等以进一步证明为SARS冠状病毒。2毒种的无菌试验应根据中国生物制品规程疫苗生产用毒种的要求进行无菌试验检查。3毒种的外源因子检查应用证明为SARS病毒感染的单人份病人血清中和本病毒。完全中和病毒后（如不能一次中和，可用另一病人血清再一次中和后）按下列方法进行动物和细胞检查。（1）动
9、物试验法小鼠取15-20g小鼠至少10只，用经中和后的病毒悬液，每只脑内接种003ml，腹腔接种05ml。至少观察21天。解剖所有在试验24小时后死亡或有患病体征的小鼠，为了检查病毒感染的证据，直接肉眼观察其病理改变，并将有病变的相应的组织悬液通过脑内和腹腔接种另外至少5只小鼠并观察21天。如果没有小鼠表现出病毒感染现象，则病毒种子符合要求。在观察期内至少有80%最初接种的小鼠存活试验才有效。乳鼠出生后24小时以内的乳鼠，至少10只，用经中和后的病毒悬液，脑内接种001ml，腹腔接种至少01ml。每天观察，至少14天。解剖所有在试验24小时后死亡或有患病体征的小鼠，直接肉眼观察其病理改变，并取
10、有病变的相应的组织和脑、脾制备成悬液脑内和腹腔接种另外至少5只小鼠并每天观察，观察14天。如果没有小鼠表现出有病毒感染现象，该病毒种子通过试验。在观察期内至少有80%最初接种的小鼠存活试验才有效。（2）细胞培养法非血吸附病毒检查中和后的病毒悬液，还应分别接种于人源、猴源和生产用的同种不同批的细胞。如果是利用人二倍体细胞生产的，还应接种另外一株人二倍体细胞。每种细胞最少接种6瓶，每瓶病毒悬液接种量不少于培养液总量的25%。于361培养，观察二周，或最后一次收获病毒液时间检查是否有CPE出现。未见CPE为阴性。血吸附病毒检查于第6-8天和第14天，每种细胞分别各取出2瓶进行血吸附，一瓶放置2-8，
11、一瓶放置20-25，30分钟后显微镜下观察，未见血球吸附现象为阴性。特别注意：鉴于我国实验室条件和所用细胞的不确定因素，用于分离病毒的细胞常常污染支原体，而细胞和病毒一旦污染支原体很难清除，为此，提醒对使用的毒种须高度重视，彻底查清毒种是否确已污染支原体，以免所选毒种不符合生产疫苗用毒种，浪费人力、物力、时间和资源。4毒种的病毒滴度鉴于目前的研究资料显示，SARS病毒在Vero细胞中的复制滴度一般可达108，在二倍体细胞中为106左右，用于疫苗研究的毒种应分别达到上述要求。5毒种免疫原性检查鉴于目前尚无测定疫苗免疫原性的有效方法和标准，建议以实验性灭活疫苗（即用已建立的毒种库制备的灭活病毒液）
12、单次或多次免疫动物后采血清测定中和抗体滴度，测定方法应为蚀斑形成减少法或细胞病变抑制法，可能时应对所测抗体的种类进行分析。用于中和抗体测定的病毒株应为非同源株，免疫用动物可考虑家兔、小鼠、豚鼠或其他敏感动物。如有条件时也可测定疫苗的ED506疫苗候选株病毒的纯化问题新分离的病毒往往是群体病毒毒种，难免存在不同特性的病毒，如毒种病毒滴度和免疫原性未达要求，必要时可考虑用终末稀释法或蚀斑形成法挑斑反复多次纯化。灭活疫苗的研制，如毒种病毒滴度和免疫原性能达到基本要求，可用现有毒种直接制备实验性疫苗，无须纯化。7毒种的其他检定按中国生物制品规程疫苗生产用毒种的要求进行二、疫苗生产用细胞鉴于目前SARS
13、病毒对各种细胞的敏感性研究，以VeroE6细胞最好，Vero细胞和二倍体细胞次之。但VeroE6细胞不能用于生产，可选择Vero细胞、和/或二倍体细胞进行研究。Vero细胞、二倍体细胞均为传代细胞，因此须建立三级细胞库。这两种细胞建立细胞库和各细胞库的各项检定应按中国生物制品规程“生物制品生产用动物细胞制备及检定规程”项下的相应要求进行。Vero细胞是由非洲绿猴肾建立的传代细胞系，至170代以后已有明显的致瘤性，一般使用的疫苗生产终末安全代次为160代以前，建议使用Vero细胞研制疫苗的机构应注意该细胞的资料。三、生产工艺研究（一）疫苗原液生产工艺的研究1生产工艺的主要技术参数（1）病毒与细胞
14、的接种比例，MOI的最佳参数。（2）细胞培养和病毒培养的最佳温度、培养时间和收获时间。（3）病毒液的收获鉴于Vero作培养基质时，后续纯化工艺去除细胞DNA时的困难，因此建议不作细胞冻化以提高病毒收获的做法。（4）灭活或裂解条件及灭活效果的验证鉴于SARS病毒的强感染和强传播特性，灭活剂的选择和灭活效果的验证尤为重要，建议如下：灭活剂根据其他疫苗的灭活经验，一般情况下可采用甲醛、-丙内酯或其他有效的灭活剂，如选择甲醛，其浓度、灭活的作用时间、作用温度、pH等条件对疫苗的抗原的活性具有较大的影响，在研究中应引起注意；如用-丙内酯应使用95%以上浓度的新试剂，-丙内酯保存时间过长引起自身聚合，影响灭活效果。-丙内酯由于能在疫苗液体中完全水解，不必考虑在成品疫苗中的残留，因此可考虑在纯化前低剂量预灭活一次，提高生产工序时的安全性，在纯化后再灭活一次以确保完全灭活。灭活效果的验证提供病毒灭活验证的详细资料。可采用敏感细胞VeroE6盲传3代，每代用直接免疫荧光验证无活病毒。（5）病毒液的浓缩和/或活性抗原的提取纯化，可考虑用膜过滤法浓缩和柱层析法或区带离心法纯化或其他有效方法。建议参照其他纯化疫苗的要求，对疫苗的总蛋白含量进行控制。（6）佐剂目前能用于疫苗的佐剂仅为铝佐剂，而铝佐剂通常使疫苗产生的抗体滞后，且增加注射局部的副反应机率。如疫苗的抗原量能满足免疫的需要，建议不加佐剂。2灭活疫
