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1、分子生物学实验方案汇集 分子生物学实验方案汇集 Hurst Dong 12/18/2007 1 总总 RNA 的提取（的提取（Trizol 法提取）法提取） 在收集到生物材料之后，最好能即刻进行 RNA 制备工作。若需暂时储存，则应以液氮 将生物材料急速冷冻后， 储存于-80冷冻柜。 在制备 RNA 时， 将储存于冷冻柜的材料取出， 立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免 RNase 的作用。 1. 提取组织 RNA 时， 每 50100mg 组织用 1ml Trizol 试剂对组织进行裂解； 提取细胞 RNA 时，先离心沉淀细胞，每 5-10 106个细胞加 1ml Tri
2、zol 后，反复用枪吹打或剧烈振荡以 裂解细胞； 2. 将上述组织或细胞的 Trizol 裂解液转入 EP 管中,在室温 1530C 下放置 5 分钟； 3. 在上述 EP 管中，按照每 1ml TRIZOL 加 0.2ml 氯仿的量加入氯仿，盖上 EP 管盖子，在 手中用力震荡 15 秒，在室温下（1530）放置 23 分钟后，12000g（28） 离心 15 分钟； 4. 取上层水相置于新 EP 管中,按照每 1ml TRIZOL 加 0.5ml 异丙醇的量加入异丙醇， 在室温 下（1530）放置 10 分钟,12000g（28）离心 10 分钟； 5. 弃上清，按照每 1ml TRIZO
3、L 加 1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（28） 离心 5 分钟，弃上清； 6. 让沉淀的 RNA 在室温下自然干燥； 7. 用 Rnase-free water 溶解 RNA 沉淀。 PCR 实验室常用 DNA 聚合酶有三种：TaKaRa TaqTM，TaKaRa EXTaqTM和 PyrobestTM DNA Polymerase。TaKaRa TaqTM是一般的 DNA 聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基 因表达的检测等。TaKaRa EXTaqTM是具有 Proof reading 活性的耐热性 DNA 聚合酶，具有一 定的保真性，而且其扩增得到的 PCR 产物
4、 3端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆 到 T-vector 可以用此酶。PyrobestTM DNA Polymerase 也是具有 Proof reading 活性的耐热性 DNA 聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的 PCR 产物为平滑末端。如果进行基因的扩 增请使用此酶。 1. 按下列组成在 PCR 反应管中调制反应液： TaKaRa TaqTM或 TaKaRa EXTaqTM的配方 Reagent Quantity, for 50l of reaction mixture 10X PCR buffer （Mg2+ free） 5 l 如 TaKaRa TaqTM加 3 l
5、 MgCl2（25mM） 如 TaKaRa EXTaqTM加 4 l 2.5mM dNTP mix 4 l 10M Primer 上游 1 l 10M Primer 下游 1 l Template DNA 1 l Taq 或 EXTaqDNA Polymerase 0.25 l Sterile deionized water Up to 50l Total 50 l /Sample PyrobestTM DNA Polymerase 的配方 分子生物学实验方案汇集 分子生物学实验方案汇集 Hurst Dong 12/18/2007 2 Reagent Quantity, for 50l of
6、reaction mixture 10X Pyrobest buffer 5l 2.5mM dNTP mix 4l 10M Primer 上游 1l 10M Primer 下游 1l Template DNA 1l PyrobestTM DNA Polymerase 0.25l Sterile deionized water Up to 50l Total 50l /Sample 反应总体积根据实际情况进行调控，可以做 2050l 以节约试剂； 将上表各成分加入到 0.2ml 或 0.5ml 灭菌的 PCR 薄壁管中； 如果不用 PCR 仪的加热盖，在反应混合液的上层加 30 50l 的矿物油
7、防止样品在 PCR 的过程中蒸发； 2. 按以下程序进行 PCR 扩增。 PCR 反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异，在实际操作中需根据具体的情况 以及 PCR 结果而进行优化。 Step Temperature, C Time, min Number of cycles Note 起始变性 9495 1-3 1 变性 9495 0.5-2 退火 37-70 0.5-2 退火温度比理论退火 温度大概低 5C，再 根据反应结果优化 延伸 70-75 根据扩增产物 的大小 25-35 每分钟延伸 1000bp 最终延伸 70-75 10 1 反应结束后，抽取扩增样品 5l，用琼脂糖凝胶电泳
8、分析扩增结果，用 DNA marker 判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。 RT-PCR Protocol: TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV) 1. 按下列组成在 PCR 反应管中调制反应液 Reagent Quantity, for 50l of reaction mixture 10One Step RNA PCR Buffer 5l 25 mM MgCl2 10l 10 mM dNTP mix 5l RNase Inhibitor (40 U/l) 1l 分子生物学实验方案汇集 分子生物学实验方案汇集 Hurst Dong 12/18/20
9、07 3 AMV-Optimized Taq 1l AMV RTase XL (5 U/l) 1l 上游特异 Primer (20 M) 1l 下游特异 Primer (20 M) 1l 实验样品 RNA（1 g Total RNA）1l RNase Free dH2O 24l Total 50l /Sample 1. 反应总体积根据实际情况进行调控，可以做 2050l 以节约试剂； 2. 将上表各成分加入到 0.2ml 或 0.5ml 灭菌的 PCR 薄壁管中； 3. 如果不用 PCR 仪的加热盖，在反应混合液的上层加 30 50l 的矿物油防止样品在 PCR 的过程中蒸发； 2 按以下条件
10、进行反应 Step Temperature, C Time, min Number of cycles Note 逆转录 50 30 1 逆转录酶失活 94 2 1 变性 94 0.5 退火 37-65 0.5 退火温度比理论退火温 度大概低 5C，再根据 反应结果优化 延伸 72 根据扩增产 物的大小 25-35 Taq酶 每 分 钟 延 伸 1000bp 最终延伸 72 10 1 反应结束后，抽取扩增样品 5l，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用 DNA marker 判 断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。 琼脂糖核酸电泳琼脂糖核酸电泳 1. 用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放
11、在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子； 2. 根据欲分离 DNA 片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖 干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般 2030 ml） ； 3. 放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶 液，倒入电泳槽中，待其凝固； 4. 室温下 3045 分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内； 5. 向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面 1mm 为宜，如样品孔内有气泡，应设法 除去； 6. 在 DNA 样品中加入 10体积的载样缓冲液（loading buffer） ，混匀后，用枪将
12、样品混合 液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内； 7. 接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记 DNA 样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的 一端为负)。一般 60100V 电压，电泳 2040min 即可； 8. 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳； 分子生物学实验方案汇集 分子生物学实验方案汇集 Hurst Dong 12/18/2007 4 9. 电泳完毕， 关上电源， 在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置， 并与核酸分子量标准 Marker 比较被扩增产物的大小。 琼脂糖凝胶浓度与线形 DNA 的最佳分辨范围 琼脂糖凝胶浓度 线形 DNA 的最佳分辨范围（bp） 0.5% 1,00030,0
13、00 0.7% 80012,000 1.0% 50010,000 1.2% 4007,000 1.5% 2003,000 2.0% 502,000 胶回收纯化胶回收纯化 DNA 1. 琼脂糖电泳，将特异电泳带用刀切下放入到 EP 管中，称琼脂糖带的重量； 2. 按照每 100mg 加 400l 的量加入 binding buffer，放入到 EP 管振荡器中，4555温 育振荡，直到所有的琼脂糖都溶解（大概要 5 分钟） ； 3. 取出纯化柱，将上述溶解液转移至柱中，室温下放置 2 分钟，8,000rpm 离心 1 分钟，弃 EP 管中的液体，将纯化柱放回 EP 管中； 4. 加 500l 的
14、 wash buffer 至柱中，8,000rpm 离心 1 分钟。弃管中的溶液； 5. 重复操作 4 步的操作 1 次，最后将纯化柱放入 EP 管中 10,000rpm 离心 30 秒，除去痕量 的 wash buffer； 6. 将纯化柱放入一个新的 EP 管。加 3040l H2O 或者 elution buffer 至纯化柱膜的中央，在 37或 50下放置 2 分钟，10,000rpm 离心 1 分钟洗脱 DNA，将 EP 管中的 DNA 溶液放 在-20保存。 7. 注：若想要不电泳而直接纯化 DNA 溶液，只需要在第 2 步中按 100l 液量加 400l 的 binding bu
15、ffer,其余的步骤不变。 大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒 DNA 的提取（碱裂解法）的提取（碱裂解法） 此方法适用于小量质粒 DNA 的提取提取的质粒 DNA 可直接用于酶切 PCR 扩增。 1. 取 1.5ml 细菌培养物于 EP 管中，4000rpm 离心 1 分钟，弃上清液，使细菌沉淀尽量干燥； 2. 将细菌沉淀重悬于用冰预冷的 100 l 溶液 I (50 mmol/L 葡萄糖， 10 mmol/L EDTA pH 8.0， 25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 中，剧烈振荡； 3. 加入 200 l 新配制的溶液 II(0.2 mol/L NaOH，1SDS（m/v）)，盖紧 EP 管口，快速颠 倒离心管 5 次，以混合混合物，确保离心管的整个内表面与溶液 II 接触，不要涡旋，置 于冰浴中； 4. 加入 150 l 预冷溶液 III(每 100 ml 的溶液 III 中含 60 ml 5 mol/L 乙酸钾， 11.5 ml 冰乙酸， 28.5 ml H2O)， 盖紧 EP 管口， 反复颠倒数次， 使溶液 III 在粘稠的细
