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1、微生物工程复习提纲一、微生物工程概论微生物产品的四大类型：微生物菌体细胞、微生物细胞的代谢产物（初生和次生代谢）、通过微生物细胞转化的类型（药物、激素）、微生物分泌的蛋白和酶类。微生物工程的发展简史1）传统的微生物发酵技术天然发酵2）第一代微生物发酵技术纯培养技术的建立：1.1680年列文虎克发明显微镜，第一个通过显微镜观察到用肉眼看不见的微生物，包括细菌、酵母等。2.1857年法国人巴斯德发现并证明了酒精发酵是由活酵母引起的，各种不同的发酵产物是由不同的微生物产生的。3.1897年德国的毕希纳进一步证明酶对发酵的作用，为微生物工程奠定了牢固的基础。4.十九世纪初德国人科赫首先发明固体培养基，
2、得到了细菌的纯培养物，由此建立了细菌的纯培养技术。3）近代微生物发酵技术深层培养技术 4）第三代微生物发酵技术微生物工程二、微生物的代谢调节和代谢工程1. 代谢工程基本思路：根据已有的遗传和生化知识，找出限速步骤，进行遗传操作 2.代谢工程的设计：改变代谢途径，扩展代谢途径，转移或构建新的代谢途径。三、菌种的来源与选育1.微生物工程的工业生产水平的决定要素：生产菌种的性能，发酵及提纯工艺条件（发酵工艺的优化和提取工艺的优化），生产设备。其中第一步优良的菌种是最重要的。2.分离纯化、筛选菌种的一般步骤：调查研究（资料查阅） 试验方案设计 标本采集 标本的预处理 富集培养 菌种初筛 菌种复筛 性能
3、鉴定 菌种保藏3.标本预处理常用的方法：物理方法：加热、膜过滤、离心等。化学方法：加碳酸钙提高pH值等。诱饵法：将固体基质加到待检的土壤或水中，待其菌落长成后再铺平板。预处理的目的：可大大提高菌种分离的效率。富集培养：指给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件，从而增加混合菌群中所需菌株的数量，而得以快速分离纯化的目的。四、优良菌种的选育1.优良菌种选育的方法：自然选育、诱变选育、抗噬菌体菌种的选育、杂交育种、原生质体融合技术、基因工程技术。2名词解释：自然选育：不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程。诱变育种：利用各种被称为诱变剂的物理因素和化学试剂处理微
4、生物细胞，提高基因突变变频率，再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。杂交育种：将不同菌株的遗传物质进行交换、重组，使不同菌株的优良性状集中在重组体中，得到具有新性状的菌株。原生质体融合技术：将遗传性状不同的两种菌(包括种间、种内及属间)融合为一个新细胞的技术。即实现遗传重组。准性生殖：3常用诱变剂：物理诱变剂、化学诱变剂（碱基类似物，与碱基反应的物质、在DNA分子中插入或缺失一个或几个碱基）、生物诱变剂（噬菌体，转座子）。4.诱变育种的基本过程：选择合适的出发菌株 制备待处理的菌悬液 诱变处理 筛选 保藏和扩大培养P53.(选择)5.（大题）诱变育种的基本方法：1）出发菌株选
5、择一是考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能力或潜力，即菌株是否具有产生特定代谢产物的催化酶系的基因。菌株来源是从自然界中分离得到的野生型菌株；通过生产选育，即由自发突变经筛选得到的高产菌株；已经诱变过的菌株。 其次是出发菌株最好已具备一些有利的性状，如生长速度快、营养要求低和产孢子早而多的菌株。2）制备菌悬液：待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的均一性和环境条件。一般要求菌体处于对数生长期，并采取一定的措施促使细胞处于同步生长。悬液的均一性可保证诱变剂与每个细胞机会均等并充分地接触，避免出现不纯的菌落，给后续的筛选工作造成困难。 菌悬液的细胞浓度一般控制为：真菌孢子或酵母细胞10610
6、7个/ml，放线菌或细菌108个/ml。菌悬液一般用生理盐水（0.85%NaCl）稀释。3）诱变处理：诱变剂剂量选择 ：在诱变处理前，一般应预先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。不同微生物，使用的剂量不同；诱变率随诱变剂剂量的增加而提高。但达到一定剂量后，再加大剂量反而会使突变率下降。诱变剂使用：单一诱变剂处理；复合诱变剂处理 6（大题）原生体的融合技术一般步骤：选择亲株、原生质体的制备、原生质体的融合、原生质体再生和融合子选择等步骤。（常用的试剂）方法：1）选择亲株：选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株。为了能明确检测到融合子，参与融合的亲株一般都需要带有可以识别
7、的遗传标记，如营养缺陷型或抗药性等 2）原生质体制备：去除细胞壁是制备原生质体的关键。培养基中添加甘氨酸，可以使菌体较容易被酶解。在菌体生长阶段添加蔗糖也能提高细胞壁对溶菌酶的敏感性。在菌体生长对数期加入适量青霉素，就能使细胞对溶菌酶更敏感。菌龄：对数生长中期细胞的细胞壁中肽聚糖含量很低，对溶菌酶敏感。一般是将原生质体放在高渗的环境中以维持它的稳定性。3）原生质体融合：聚乙二醇（PEG）能有效地促进原生质体融合。一般PEG的使用浓度范围在25-40%。采用电融合仪：在高频电场下，用直流电穿孔来进行融合。4）原生质体再生：使原生质体重新长出细胞壁，恢复完整的细胞形态结构。不同微生物的原生质体的最
8、适再生条件不同，最重要的一个共同点是都需要高渗透压。5）融合重组子的筛选：通过两亲株遗传标记的互补而得以识别 。如两亲株的遗传标记分别为营养缺陷型A+B-和A-B+，融合重组子应是A+B+或A-B-。7.基因工程技术的主要步骤基因工程技术：将一个含有目的基因DNA片段经体外操作与载体连接，并转入一受体细胞（通常多为细菌），使之扩增、表达的操作过程。一般过程方法：含目的基因的DNA片段的准备；载体；含目的基因的DNA片段与载体相连接；将重组分子送入受体细胞，并于其中复制、扩增；筛选出带有重组DNA的转化细胞；鉴定外源基因的表达产物五、菌种的保藏的方法（原理：P78 选择题）1斜面低温保藏法：将菌
9、株接种于合适斜面培养基上，而后置于4冰箱保藏，每隔一定时间进行移接培养后再将新斜面继续保藏。这种保藏方法简单，存活率高，易于推广，经常使用的菌种可采用这种方法。其缺点是菌种仍有一定强度的代谢活动条件，保存时间不长，而且传代多，因此菌种客易产生变异。 2、液体石蜡保藏法：将生长好的新鲜斜面在无菌条件下倒入已灭菌的液体石蜡，油层要高出斜面上端1cm，使之与空气隔绝，然后垂直放于室温或冰箱内保藏即可。这种方法也比较简便，且保藏时间一般可长达l年以上。适于保存部分霉菌、酵母菌、放线菌，但对细菌效果较差，对某些能同化烃类的微生物则不适用。3、砂土管保藏法：将孢子悬浮液转移至灭过菌的砂土管中，于真空干燥器
10、内用真空泵抽干，再转至有干燥剂的容器中，密封低温保藏。该法是用人工方法模拟自然环境使菌种得以栖息。适用于细菌的芽孢、霉菌和放线菌孢子的保藏，不适于对干燥敏感的无芽孢的细菌和酵母菌。主要包括砂土管制备和真空抽干两步。4、真空冷冻干燥保藏法：在低温下迅速将细胞冻结以保持细胞结构的完整，然后在真空下使水分升华。这样菌种的生长和代谢活动处于极低水平，不易发生变异和死亡，可长期保存，一般为510年。微生物在此条件下易死亡，所以需加入一些物质作保护剂，一般常用的是脱脂牛奶、血清等。该法存活率高，变异率低，并能广泛适用于细菌（有芽孢和无芽孢的）、酵母、霉菌孢子、放线菌孢子和病毒等，因此是目前广泛采用的好方法
11、。其缺点是手续麻烦，操作复杂，要求严格，并需有一定设备条件。 5、液氮超低温保藏法：适用范围最广的超低温保藏法。其原理是液氮的温度可达-196 ，远远低于其新陈代谢作用停止的温度（-130 ），此时，菌种的代谢活动停止，化学作用亦随之消失。注意点：安瓿管是否完好、冷冻的速度、液氮的添加6、悬液保藏法：即寡营养保藏，将微生物悬浮在不含养分的溶液中，如蒸馏水等。保藏的关键：试管密封好，以防水分蒸发。7、低温保藏法：多数微生物可在-20 以下的低温中保藏。注意：融化后的菌种不能再用低温保存，要重新移种后再冷藏。保藏方法斜面冰箱保藏法 4； 3-6个月沙土管保藏法 产孢子或芽孢微生物，1年菌丝速冻法
12、甘油或二甲基亚砜作为保护剂，-20 石蜡油封存法 1年左右真空冷冻干燥保藏法 任何微生物；一般5年以上液氮超低温保藏法 -196；保护剂；保存期长六、培养基1.培养基的类型：根据来源不同，分为：天然培养基：采用化学成分不清楚或化学成分不恒定的各种动植物或微生物的浸出物、水解液等物质制成的。合成培养基：用化学成分和数量完全了解的物质配制而成，成分精确，重复性强，可减少不能控制因素。半合成培养基：既含有天然成分又含有纯化学试剂的培养基。根据物理性状不同，分为：液体培养基，固体培养基，半固体培养基根据主要成分和使用目的，分为：基础培养基增殖培养基鉴别培养基：培养基中加有能与某一菌的无色代谢物发生显色
13、反应的指示剂。选择培养基：根据某生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基。根据生产工艺的要求，分为：孢子培养基，种子培养基，发酵培养基。种子培养基：满足菌种生长用的。营养丰富，氮源、维生素比例较高。发酵培养基：满足大生产中大量菌体生长和繁殖以及代谢产物积累的营养物质。2微生物培养基的成分（常用的种类，作用，类型）：碳源，氮源，无机盐，微量元素，生长因子，促进剂和抑制剂，前体和水。3常用碳源：糖类、脂类、有机酸、低碳醇。糖类：葡萄糖（纯葡萄糖、水解淀粉），乳糖（纯乳糖、乳清粉），淀粉（大麦、花生粉、燕麦粉、黑麦粉、大豆粉等），糖蜜（甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、粗红糖、精白糖等）脂类如
14、各种植物油和动物油也能被许多微生物用作碳源和能源。有机酸：如乳酸，醋酸，柠檬酸，延胡索酸等3.氮源：分为无机氮源和有机氮源1）无机氮源：种类：铵盐、硝酸盐和氨水。特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化。选择合适的无机氮源的意义：满足菌体生长，稳定和调节发酵过程中的pH 2）有机氮源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。如：玉米浆含有可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸；较多的乳
15、酸硫、磷、微量元素等有机氮源成分复杂，可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响。使用注意：有机氮源和无机氮源应当混合使用；早期：容易利用易同化的氮源无机氮源；中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质。有些产物会受氮源的诱导和阻遏。4.无机盐：磷酸盐、硫酸镁、钾盐、微量元素（锰、铁）等。来源：C、N源，以盐的形式补充；使用注意点：对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑；使用时注意盐的形式（pH的变化）。5,。名词解释：前体：某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入而有较大的提高。产物促进剂：那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。抑制剂：可以抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一代谢途径，以致可以改变微生物的代谢途径。6.培养基的优化培养基设计与优化的大致步骤：1）根据前人的经验和培养基配制的基本理论，初步确定可能的成分；
