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1、PCR-单链构象多态性 (PCR-single-strand conformation polymorphism,SSCP),单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象,这种立体结构主要是由 其内部碱基配对、氢键等分子内相互作用力来维持的,当有一个碱基发生改变时,会或多或 少地影响其空间构象,使构象发生改变,空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),可以非常 敏锐地将构象上有差异的分子分离开。该方法即为单链构象多态性 (Single-Strand Conformation Polymorphism,SSCP)分析。,基本原理,将SS
2、CP用于检查PCR扩增产物的基因突变,建立PCR-SSCP技术。 基本过程: PCR扩增靶DNA; 将特异的PCR扩增 产物变性,而后快速复性,使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子; 将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳; 最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果。 若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变,就可以判定该链构象发生改变,进而推断该DNA片段中有碱基突变。,PCR-SSCP基本过程,SSCP的应用,进行人类DNA多态性分析,大量地用于检测和肿瘤发生 有关的基因突变。 如检测星形细胞瘤、脑瘤、小细胞肺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中的 p53基因的突变、肺癌的r
3、as基因突变等。 用于检 测引起人类遗传性疾病的研究上 。 如在囊性纤维化中起作用的CFTR基因、神经纤维瘤 1型基因、家族性结肠息肉基因的研究中。 用于病毒的分型、监测PCR实验中的污染 情况、以及病原体传播途径的研究中。 Yap用巢式PCR对来自不同国家和地区的HBV标品 进行了检测,并对扩增产物进行了SSCP分析,发现每个标本的SSCP图谱完全不同 ,不仅证明了HBVDNA具有地区性变异,而且排除了交叉性污染的可能性。,2.制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG) (1)电泳槽玻璃板的处理:用洗涤剂清洗玻璃板,自来水反复冲净洗涤剂,双蒸水冲洗,95乙醇擦拭,通风橱自然晾干。两块玻璃对齐,底部和两侧用
4、橡胶条封好,用1%琼脂糖胶封底,固定在垂直电泳槽上。 (2) 制胶:按照被分离DNA片段的大小、含量及玻璃板、衬条的大小决定凝胶的浓度与体积,一般来讲使用58的凝胶较为合适。,PCR-SSCP的实验操作,在小于1Kb长度的情况下,DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:,PCR-SSCP的实验操作,PAGE的制备:,成分: 浓度:8% 10% 40%丙烯酰胺 8ml 10ml ddH2O 26ml 24ml 甘油 4ml 4ml 10 TBE 2ml 2ml TEMED 40ul 40ul 10%AP 600ul 600ul,PCR-SSCP的实验操作,10TBE:Tris 108 g,硼酸
5、55 g,0.5 mol/L EDTA(pH8.0)40ml,定容至1000 ml,高压灭菌,4贮存。 40%丙烯酰胺贮备液(交联度49:1):39.2 g丙烯酰胺,0.8 g甲叉双丙烯酰胺,溶解后定容至100 ml,过滤,避光4贮存。 10过硫酸铵:过硫酸铵 0.1 g 溶于1 ml蒸馏水,4贮存数周。 2上样缓冲液:甲酰胺 9.5 g,0.5mol/L EDTA 0.4 ml,二甲苯蓝FF 5 mg,溴酚兰 5 mg,加水溶解,定容到10ml。,试剂配制:,PCR-SSCP的实验操作,(3)按上表配制合适浓度的胶液,轻轻摇匀。用1ml移液器吸取胶液,缓慢注入两玻璃板间的空隙中,直至灌满模具
6、顶部,立即插入相应的点样梳,(小心勿使梳齿下带进气泡,并且不要将梳齿全部插入胶内,留约2mm梳齿于玻璃板上端,以免拔梳时把胶孔拔断)。由于凝胶在聚合过程中有回缩,所以应小心添加些胶液于梳子处,水平放置,室温聚合1hr。小心取出点样梳,在电泳槽内灌入 1TBE电泳缓冲液,用槽内的缓冲液反复冲洗点样孔,以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和气泡。样品上胶前预电泳约30分钟。,PCR-SSCP的实验操作,3.扩增产物的处理:取0.4-1.2lPCR扩增产物,加入15l 2上样缓冲液中,混匀。100C变性10min,立即冰浴骤冷2分钟以上。然后将10l混合物上样,以微量加样器上样。上样时要注意不要有气泡
7、冲散样品,而且速度要快,时间长了样品易于扩散。,PCR-SSCP的实验操作,4.电泳:根据扩增片段的大小及电泳槽和凝胶的大小,决定电泳的电压及电泳时间。通常室温下以l5Vcm电泳。 5.剥胶:电泳结束后,回收电泳缓冲液,取下电泳胶玻璃,用塑料楔子从玻璃板底部一角小心分开玻璃,凝胶应附着在一块玻璃上,切去凝胶左上角,作为点样顺序标记。,PCR-SSCP的实验操作,6.银染法,试剂: 1.固定液(10%无水乙醇):无水乙醇50ml,双蒸水定容至500ml。 2.1%硝酸溶液:5ml硝酸,双蒸水定容至500ml。 3.0.2%硝酸银溶液(现配):1g硝酸银,双蒸水定容至500ml。 4.显色液:15
8、g无水碳酸钠,溶于500ml双蒸水,同时加入250ul甲醛,混匀。临用时配制。,PCR-SSCP的实验操作,步骤:,1.凝胶用固定液浸泡5-10分钟,双蒸水漂洗2遍,每次2 min ; 2.1%硝酸溶液浸泡5分钟,双蒸水漂洗2遍; 3.0.2%硝酸银溶液浸泡20分钟,双蒸水漂洗2遍,每次约10 s,轻轻漂洗 ; 4.显色液中显色至条带清晰而背景不至于过深,双蒸水漂洗2遍; 5.银染后的凝胶经SmartView成像,拍摄,电脑保存。,PCR-SSCP的实验操作,由于在SSCP分析中非变性PAG电泳不是根据单链DNA分子和带电量的大小来分离的,而是以单链DNA片段空间构象的立体位阻大小来实现分离的
9、,因此,这种分离不能反映出分子量的大小。有时正常链与突变链的迁移率很接近,很难看出两者之间的差别。因此一般要求电泳长度在16-18cm以上,以检测限为指标来判定结果。检测限是指突变DNA片段与正常DNA片段可分辨的电泳距离差的最小值。大于检 测限则判定链的迁移率有改变,说明该DNA序列有变化,小于检测限则说明链之间无变化。例如,一般检测限定为3mm,那么当两带间距离在3mm以上,则说明两链之间有 改变。另外检测限不能定的太低,否则主观因素太大,易造成假阳性结果。另外,SSCP 分析中其它条件,如PCR产物的上样量,PAG的交联度、以及胶的浓度等,都应根据具体实验进行选择确定。,SSCP结果,S
10、SCP结果,对出现异常泳动条带的样品,从PCR扩增到SSCP,均重复3次,获相同结果,再送测序确证,以排除PCR反应中的错配或电泳条件差异引起的偶然现象,既使结果可靠,又避免不必要的测序。,质量控制,1.DNA片段的大小和组成:用于SSCP分析的DNA片段越小,检测的敏感性越高。200 bp的DNA片段检出率为90%,200500 bp的DNA片段检出率为7080%,而500 bp的DNA片段检出率50%。对于大于400bp的PCR产物就需要设法进一步处理,可以用限制性酶消化PCR产物,产生小于400bP的DNA片段,再进行SSCP分析。另一方面,核酸片段中碱基的组成以及突变位点临近的核酸序列
11、也可能影响其电泳速度,如富嘌呤序列较富嘧啶序列对碱基变异更敏感。,PCR-SSCP注意事项,2.PCR产量和特异性:PCR扩增产物的高度特异性是SSCP成功的前提。首先要优化PCR反应条件,以免非特异扩增带干扰结果分析;其次要避免PCR操作过程的污染。在使用大量PCR产物时,变性的单链DNA会很快地复性,从而影响SSCP检测的敏感性;但如果减少PCR产量,则可能因为单链DNA太少而降低敏感性,所以上样量也要进行摸索。,PCR-SSCP注意事项,3. 游离引物: 游离引物可能同 PCR产物结合而改变其泳动率,即使游离引物量为6nM都有明显影响。因此,应尽可能除去游离引物。可以采用不对称引物扩增方
12、法,尽可能消耗多余的引物。也可以运用过柱或磁性球方法纯化PCR产物。或者是稀释PCR产物,减少游离引物的干扰。,PCR-SSCP注意事项,4.低浓度变性剂: 凝胶中加入低浓度的变性剂,如5-10甘油、5尿素或甲酸胺、10二甲亚砜(DMSO)或蔗糖等有助于提高敏感性,可能是因为轻微改变单链DNA的构象,增加分子的表面积,降低单链DNA的泳动率。但有些变异序列却只能在没有甘油的凝胶中被检出。因此,对同一序列使用23种条件做SSCP,可能提高敏感性。,PCR-SSCP注意事项,5.凝胶浓度、交联度及厚度: 凝胶浓度和交联度决定凝胶孔径大小,因而影响单链DNA泳动速度和对构象的分辨率。不同大小DNA片
13、段的最适浓度不同,本人以往实验根据有关文献选择了8%凝胶。凝胶浓度不同,突变带的相对位置也不相同,如果在进行未知突变种类的SSCP分析时,最好采用两种以上凝胶浓度,这样可以提高突变种类的检出率。凝胶的厚度对SSCP分析也很重要,凝胶越厚,背景越深,在上样量较多的前提下,尽量使凝胶越薄越好。,PCR-SSCP注意事项,6.电泳温度:单链DNA的构象取决于温度和分子内部弱的稳定力之间的平衡,温度是SSCP分析中至关重要的影响因素,不同的DNA片段应尽可能调试在最适温度下进行电泳,一般4-15之间。但由于在电泳时温度会升高,为确保电泳温度相对恒定,应采取以下措施:减少凝胶厚度,降低电压,有效的空气冷
14、却或循环水冷却等。,PCR-SSCP注意事项,PCR-SSCP注意事项,7.电泳电压的影响: 在电泳过程中除环境温度外,电压过高也是引起温度升高的主要原因,因此,在没有冷却装置的电泳槽上进行SSCP时,开始的5min应用较高的电压(550V),以后用400V左右电压进行电泳。这主要是由于开始的高电压可以使不同立体构象的单链DNA初步分离,而凝胶的温度不会升高.随后的低电压电泳可以使之进一步分离。在实验中应根据具体实验条件确定电泳电压。,8.假阴性: 一般认为,如没有污染,PCRSSCP分析不存在假阳性结果,但可能出现假阴性结果,后者是由于点突变引起的空间构象变化甚微,迁移率相差无几所致,尤其是
15、点突变发生在扩增片段的两端时。如果有阳性和阴性对照,结果可以重复确定的突变带是可信的,如果没有阳性对照,应经测序来确定其是否为突变带。由于PCRSSCP的不足之处主要是可能检出假阴性结果。应通过设置阳性对照,摸索电泳条件,假阴性结果在很大程度上是可以避免的。但对未知基因变异的检测,假阴性结果就难以百分之百地消除。,PCR-SSCP注意事项,9.结果分析: 单链凝胶电泳时,互补单链迁移率不同,一般形成两条单链带。PCR产物进行单链凝胶电泳之前,通过加热变性产生单链。如变性不彻底,残留双链亦可形成一条带。因此,PCRSSCP分析结果至少显示三条带。但是,由于一种DNA单链有时可形成两种或多种构象,检出三条或四条单链带就不足为奇。,PCR-SSCP注意事项,