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1、输血相关传染病检测技术 概 述,甘肃省平凉市中心血站实验室 吴 宏 涛,输血相关传染病种类,病毒性肝炎 乙、丙、丁、庚型肝炎 艾滋病 梅毒 巨细胞病毒 EBV感染 HTLV感染（美国、欧盟及我国的厦门血站开展） 疟疾 弓形体病等,输血相关传染病检测方法,酶联免疫吸附试验ELISA* 免疫荧光法IFA 放射免疫法RIA 免疫印迹法WB* 重组免疫印迹法RIBA 颗粒凝集实验PA 病毒检测VT 病毒核酸检测NAT*,酶联免疫吸附试验ELISA,建于1971年。开创了运用酶标记免疫技术进行液体标本中微量物质的测定，是检验医学的里程碑式的发展。 特点：敏感性高，特异性强，操作简便，即可测定抗原，也可测
2、定抗体。 类型：间接法，直接法，双抗体夹心法，竞争抑制法或竞争法。,放射免疫法RIA,一种用放射性同位素为标记物的免疫学测定方法，具有很高的敏感性与特异性。其原理与ELISA大致相同，所不同的是用放射性同位素为标记物而不是用酶为标记物。,免疫印迹试验WB,又名蛋白印迹试验，其原理是在病毒裂解后将不同分子量的病毒蛋白经十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯胺凝胶电泳（PAGE）分离后，经过电转移将凝胶上的蛋白条带转移到位硝酸纤维素膜上，以此作为抗原进行病毒特异性抗体检测。,重组免疫印迹试验RIBA,原理：应用重组蛋白或合成肽（而不是直接应用病毒裂解的蛋白）以条带形式吸附在硝酸纤维素膜条上，当条上加入被测
3、血清标本温育后，如果标本中含有特异性抗体时，则和相应抗原带结合形成抗原抗体复合物。通过洗涤，去掉未结合的血清，然后加入酶标IgG二抗，再温育，则酶结合物就结合到抗原抗体复合物上，再洗涤，加入底物。,颗粒凝集试验PA,是一种简便快速的筛检试验，其原理为病毒裂解物或重组抗原包被于颗粒载体（红细胞，乳胶颗粒，明胶颗粒），使之成为致敏颗粒，再加入血清标本，如被测血清中含有特异性抗体，则因抗体与抗原间桥联作用，使致敏颗粒发生凝集。,病毒检测VT,可通过病毒的分离和培养后进行。培养可通过动物培养，鸡胚培养和细胞培养进行，其中以细胞培养方法最敏感、经济和最有前途。病毒感染细胞后，多数病毒能引起病变，可直接镜
4、检观察，或通过血清学检查作出鉴定。,病毒的核酸检测NAT,病毒核酸分子杂交 聚合酶链反应PCR,乙型肝炎的检测技术,1 乙肝病毒的生物学性状,形态与结构 基因结构与复制方式 抗原组成 动物模型与细胞培养 抵抗力,1.1 HBV形态与结构,HBV结构为双层球形，直径42nm，具有双层衣壳。,1.2 HBV基因结构与复制方式,HBV的DNA基因较小，仅含约3200个核苷酸，负股DNA核苷酸序列含有4个开放读码框架（OPR）分别称为S、C、P和X区。 基因及其编码的抗原： S区基因 C区基因 P区基因 X区基因 S基因HBsAg C基因 HBcAg 前S1 Pre-S1 前C基因 HBeAg DNA
5、多聚酶 HBXAg 前S2基因Pre-S2,1.3 HBV抗原的组成,表面抗原HBsAg 三种形态 小球型颗粒、管形颗粒、Dane颗粒 亚型 各亚型均有共同抗原决定簇，称为a抗原，此外还有2组相互排斥的亚型抗原决定簇（d/y和w/r）。按不同的组合方式构成HBsAg四个基本亚型，即adr,adw,adr,ayw。亚型的分布有明显的地区差异和种族相关性，汉族以adr，少数民族为ayw，欧美以adw占优势，ayw主要分布在北非和西非。乙肝ELISA诊断试剂的标准要求adr,adw, ayw三个亚型的最小检出量为0.5ng/L。 核心抗原HBcAg 为内衣壳部分，不易在血循环中检测，抗原性强。 e抗
6、原HBeAg 病毒复制和具有强感染性的指标。,1.4 HBV动物模型与细胞培养,黑猩猩是对HBV最敏感的动物。 目前采用的细胞培养系统是病毒DNA传染系统。将病毒DNA导入肝癌等细胞后，病毒可整合并复制，在细胞中表达HBV抗原。,1.5 HBV抵抗力,HBV 的抵抗力较强，在30-32可存活6个月，在-20可存活15年，对低温、干燥、紫外线均有耐受。不能被70%乙醇灭活，因此不能用这一常规方法来消毒。但6510 小时 、煮沸10 分钟 或高压蒸气均可灭活HBV。含氯制剂、环氧乙烷、戊二醛、0.5%过氧乙酸和碘伏等也有较好的灭活效果。 消毒可以使HBV失去传染性，但是HBsAg的抗原性仍可保留。
7、,1.6 HBV markers during early infection,Infection Day 0 HBV DNA Variable, up to 31 days prior to HBsAg by ID NAT( 9-11 days by MP NAT) HBsAg Day 59; disappears Day 120,Infection,120,Infection Day 0 HBV DNA Variable, up to 31 days prior to HBsAg by ID NAT( 9-11 days by MP NAT) HBsAg Day 59; disappear
8、s Day 120,Infection,2 乙型肝炎病原体检测,病毒直接标志物 病毒抗原： HBsAg、HBeAg、Pre-S1、Pre-S2 病毒核酸： HBV DNA 间接性标志物 抗病毒抗体： HBsAb、HBeAb、HBcAb,2.1乙肝抗原抗体的检测及结果分析,HBsAg 阳性表示HBV 感染;抗-HBs 为保护性抗体;HBeAg阳性可作为HBV 复制和传染性高的指标;抗-HBe 阳性表示HBV 复制水平低(但有前C 区突变者例外) ;抗-HBc 总抗体主要是抗-HBc IgG,只要感染过HBV ,无论病毒是否被清除,此抗体均为阳性;抗-HBc IgM 阳性提示HBV 复制,多见于乙
9、型肝炎急性期。 近些年有许多实验室开展了乙肝前S1 抗原检测,前S1 抗原在病毒感染、装配、复制和刺激机体产生免疫反应等方面起着十分重要的作用,被认为是比HBeAg 更敏感的病毒复制标志,尤其适合无条件开展HBV DNA 检测的医疗单位。 微粒子酶免分析法(MEIA) 及化学发光法虽然灵敏度更高, ,但由于价格昂贵并未能广泛开展。 HBV 血清学标志物检测技术的发展趋势是从定性检测转变为定量分析。 HBV 血清学标志传统上包括HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc 和抗-HBc Ig M。,2.2 HBV DNA 及其基因型、变异和cccDNA 的检测1,HBV DNA 检
10、测 HBV DNA 定性和定量检测反映了病毒复制情况或水平,主要用于慢性HBV 感染的诊断、血清HBV DNA 水平的监测,以及评价抗病毒疗效,多使用各种PCR 技术。 基因型和变异的检测 HBV 病毒可分为8 型,分别为A、B、C、D、E、F、G、H。HBV 基因分型常用的方法有:多重PCR 法;限制性片段长度多态性分析法;线性探针反向杂交法;全基因序列测定法等。全基因序列测序分型的结果准确性高,尤其是能发现两种不同基因型的重组体感染,被公认为HBV 基因分型的金标准,但比较昂贵繁琐,不适合常规应用。 目前的研发趋势是针对有重要临床意义的HBV 变异进行快速、定量的多位点联合检测。,2.2
11、HBV DNA 及其基因型、变异和cccDNA 的检测2,cccDNA（共价闭合DNAcovalent closed circular） 的检测 cccDNA 是HBV 的原始复制模板,对乙肝病毒的复制及感染状态的建立具有十分重要的意义。Southern blot 是检测HBV cccDNA 的经典方法,但是该方法过程比较复杂,而且灵敏度不高。实时荧光定量PCR 不需对PCR 反应产物进行开盖检测,从而减少了PCR 产物污染的可能 ,可对cccDNA 进行定量分析,多被实验室采用。,2.3 乙肝病毒微生物学检查法,HBV感染宿主的免疫学监测 HBV 感染的病程很大程度上取决于宿主的免疫机能,不
12、同病程时期的机体免疫特点、体内病毒水平和肝脏损伤程度均不相同,临床免疫学检测对HBV 感染的各病程阶段的免疫状态判断、指导治疗和评价疗效等方面都有重要的意义。 流式细胞仪可以同时准确检测几种T淋巴细胞亚群的数量,监控病人的免疫状态,被实验室广泛应用。,3 乙肝诊断试剂的研制进展,抗-HBs诊断血清 血凝试验 反向被动血凝试验 RPHA 被动血凝试验PHA 放射免疫试验RIA 酶联免疫测定法（ELISA）试剂 DNA聚合酶链反应PCR HBsAg全血金标检测试纸条,4 检测乙肝时常见问题1,阳性漏检的问题 一步法试剂的钩端效应，后带现象。试剂的标准中对一步法试剂有3份1：64效价的HBsAg阳性
13、血清，检测结果要求为阳性。 灵敏度：灵敏度对于早期检出有利。 窗口期： 美国研究表明90%的HBsAg漏检是因为窗口期。 国内研究表明30%40%是因为窗口期。 亚型问题 ad型检出率要高于ay型 变异 HBsAg变异类型有很多，5070变异 株与抗野生株单抗的免疫反应减弱或消失。 有部分变异株与野生株在立体构型和抗原反应性上有明显的差异 ,因此防治困难。,4 检测乙肝时常见问题2,乙肝假阳性问题 类风湿因子RF与抗体结合，造成ELISA和金标法的假阳性。 补体与IgG的Fc段结合，造成ELISA和金标法的假阳性。 纤维蛋白原与酶结合物粘附于微板上洗不掉，造成ELISA假阳性。 稀释液推进剂，
14、金标法中应先加样品，后加释释剂，否则易出现假阴性。,丙型肝炎的检测技术,1 丙肝病毒的生物学性状,形态与结构 基因结构与功能 丙肝病毒抗体的特点与临床意义 丙肝病毒感染后ALT特点与意义 丙肝病毒的生物学检测,丙肝病毒简介,1974年Golafield首先报告输血后非甲非乙型肝炎。1989年Choc等应用分子克隆技术获得本病毒基因克隆，并命名本病及其病毒为丙型肝炎（HepatitisC）和丙型肝炎病毒（HCV）。由于HCV基因组在结构和表型特征上与人黄病毒和瘟病毒相类似，1991年， 国际病毒命名委员会(ICTV)将其归为黄病毒科丙型肝炎病毒属。,1.1 形态与结构,HCV病毒体呈球形，直径小
15、于80nm（在肝细胞中为36-40nm，在血液中为36-62nm），为单股正链RNA病毒，在核衣壳外包绕含脂质的囊膜，囊膜上有剌突。HCV体外培养尚未找到敏感有效的细胞培养系统，但黑猩猩对HCV很敏感。,1.2 HCV基因结构与功能,丙型肝炎病毒是单股正链RNA病毒其基因组含有一个大约9033个核苷酸构成的大开放读码框(0RF)，可编码30103033个氨基酸的多蛋白前体，多蛋白N端的14依次为核心蛋白(c)和包膜蛋白(El和E2)等结构蛋白，其余依次为NS2、NS3、NS4和NS 5等非结构蛋白 ，膜蛋白分布于病毒表面，NS3蛋白具有蛋白酶的功能，NS5蛋白为一依赖于RNA的RNA多聚酶,1
16、.3 HCV抗体的特点与临床意义,1 抗核心区抗体 抗-C22-3核心区抗体，核心区基因保守性强，其抗体出现较早（感染后8-10周），持续时间长，与HCV RNA高度相关，其血液有较大的传染性。 抗-HCe被膜区抗体，被膜区基因（E1，E2/NS1）变异程度高，其抗体可用于血清学分型，用于感染的流行病学研究。,1.3HCV抗体的特点与临床意义,2 抗非结构区抗体 抗-C33C 编码C33C多肽的基因位于NS3中区，与HCV的复制有关，用于HCV感染检测，抗-C33C 与抗-C22-3同时或稍早出现，两者对HCV感染具有互补作用，但不能相互替代。 抗-C100-3 C100-3多肽编码基因位于NS4区，从感染后4-32周出现，最长可达1年以上，对感染早期诊断意义不大，在鉴别急性、慢性感染和判断上有一定价值。但假阳性比例较高，血清中类风湿因子，过氧化物歧化酶、球蛋白、自身抗体等与多肽呈低亲和结合；标本放置过长或反复冻融也可出现假阳性。 抗-NS5 抗-NS5 持续阳性者，ALT多明显升高，而
