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1、关于汽酒中微生物的检查1主题内容与适用范围本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。本标准适用于出口食品的检验。2设备和材料2.1吸管: 1mL,具0.1mL刻度；5mL和10mL,具1mL刻度。2.2水浴箱：44.50.5。2.3培养箱：361,44.50.5。2.4冰箱: 05和-15-20。2.5均质器。2.6乳钵和研棒。2.7平皿：直径90mm。2.8天平：感量0.1g。2.9显微镜。2.10 稀释瓶：100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。2.11 玻璃珠：直径约5mm。2.12 菌落计数器。3培养基及试剂3.1月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉
2、汤。3.2煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。3.3 EC 肉汤。3.4伊红美蓝琼脂(EMB)。3.5营养琼脂斜面。3.6色氨酸肉汤。3.7 MR-VP培养基。3.8 Korser氏枸椽酸盐肉汤。3.9结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。3.10Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液。3.11 生理盐水。3.12 革兰氏染色液。3.13 Kovacs氏靛基质试剂。3.14 甲基红指示剂。3.15 Voges-pros kauer(V-P)试剂。4样品制备4.1以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检验,应将冷冻样品置于-15保存；非冷冻而易腐的食品,应置于4
3、冰箱保存。检验前冷冻样品可于25 18h内解冻,或在45以下15min内解冻。4.2不同食品样品匀液的制备4.2.1液体食品以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠),以30cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇),制成1:10的样品匀液。4.2.2固体和半固体食品以无菌操作取25 g样品,放入装有225 mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000 r/min均质12min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。4.3稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10*-2、10*-3、
4、10*-4。从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。5大肠菌群的测定5.1大肠菌群MPN值的测定5.1.1对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL。5.1.2将接种管置于361培养482h。5.1.3观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生,记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气,则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者,则进一步作证实试验。5.2大肠菌群的证实试验5.2.1将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中。5.2.2置BGLB肉
5、汤管于361培养482h。5.2.3记录所有BGLB肉汤管的产气管数。5.2.4结果报告：按BGLB肉汤产气管数,查MPN表见附录B (补充件)报告每克(毫升)样品中大肠菌群的MPN值。6粪大肠菌群测定6.1用直径为3mm的接种环将所有482h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。6.2将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.50.5水浴箱内,培养242h。水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为44.5产气阳性的大肠杆菌和44.5不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。6.3记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴
6、性。6.4结果报告：按产气管数,查MPN表报告每克(毫升)样品中粪大肠菌群的MPN值。7大肠杆菌测定7.1将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h,取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,361培养242h。7.2 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。7.3如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,361培养1824h。7.4将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。7.4.1色氨酸肉汤：在361培养242h后,加Kovacs氏试剂0.20.3mL,上层出现红色为
7、靛基质阳性反应。7.4.2 MR-VP培养基：在361培养482h。以无菌操作移取培养物1 mL至13mm100mm试管中,加5-萘酚乙醇溶液0.6mL,40氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5 滴甲基红溶液。如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。7.4.3 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于361培养96h记录有无生长。7.4.4 LST肉汤：于361培养482h,观察试管中是否产气。7.4.5革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。7.4.6大肠杆
8、菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：靛 基 质 MR VP 枸椽酸盐 鉴定(型别) 典型大肠杆菌 非典型大肠杆菌 典型中间型 非典型中间型 典型产气肠杆菌 非典型产气肠杆菌如出现上表以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯,应重新划线分离,必要时做重复试验。7.5结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为或,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN值。8大肠菌群固体培养基测定法8.1样品制备同第4章。8.2计数8.2.1选取适宜的三个连续稀释度的样品液,每个稀释度接种两个灭菌平皿,每皿1mL。另取1mL稀释剂加入一个灭菌平皿中,作空白对照
9、。8.2.2将冷至450.5的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)1015mL倾注于每个平皿中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀。8.2.3待琼脂凝固后,再加34mL VRBA覆盖平板表层。8.2.4翻转平板,置于361培养1824h。8.2.5选用有30150个菌落的平板,计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为0.5mm或更大。8.2.6证实8.2.6.1从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,移种于BGLB肉汤管内, 361培养24h和48h,观察产气情况。8.2.6.2将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。对形成菌膜的阳性管,
10、应进行革兰氏染色,以便排除革兰氏阳性杆菌。8.2.7结果报告经最后证实为阳性(产气,革兰氏阴性杆菌) 的试管百分比乘以于8.2.5条中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每克(毫升)样品中大肠菌群数。例：10*-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为：1006/1010*4/g(mL)6.010*5/g(mL)附录 A培养基和试剂(补充件)A1月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤胰蛋白(月示)或胰酪胨(Trypticase) 20g 氯化钠5.0g乳糖5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.
11、75g磷酸二氢钾(KH2PO4) 2.75g月桂基硫酸钠 0.1g蒸馏水 1000.0mL将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的20mm150mm试管中,每管10mL。121高压灭菌15min。最终pH6.80.2。A2煌绿乳糖胆盐(BGAB)肉汤蛋白胨 10.0g乳糖 10.0g牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液 200.0mL0.1煌绿水溶液 13.3mL蒸馏水 1000.0mL将蛋白胨乳糖溶于约500mL蒸馏水中,加入牛胆粉溶液200mL(将20.0g脱水牛胆粉溶于200 mL蒸馏水中,pH7.07.5),用蒸馏水稀释到975mL,调pH7.4。再加入0.1煌绿水溶液13.3
12、mL,用蒸馏水补足到1000mL,用棉花过滤后,分装到20mm150mm试管(管内有倒立的小发酵管)中,每管10mL。121高压灭菌15min。最终pH7.20.1。A3 EC肉汤胰蛋白(月示)或胰酪(月示) 20.0g3号胆盐或混合胆盐 1.5g乳糖 5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4) 4.0g磷酸二氢钾(KH2PO4) 1.5g氯化钠 5.0g蒸馏水 1000.0mL将以上成分溶解于蒸馏水中,分装16mm150mm试管(管内有倒立的小发酵管),每管8mL。121高压灭菌15min,最终pH6.90.1。A4伊红美蓝琼脂(EMB)蛋白胨 10.0g乳糖 10.0g磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.0g 琼脂 15.0g伊红(水溶性) 0.4g或2水溶液20mL美蓝0.065g或0.5水溶液13mL蒸馏水 1000.0mL在1000mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼
