《【最新】蛋白质光谱分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《【最新】蛋白质光谱分析（103页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、光谱分析技术周宏敏概述head2right在仪器分析方法中，依据物质发射、吸收电磁辐射以及物质与电磁辐射的相互自由泳而建立起来的一类分析方法，广义上成为光学分析法。它可分为光谱法（或波谱法）和非光谱法两大类。head2right光谱法是以辐射能与物质组成和结构之间的内在联系及表现形式光谱的测量为基础。head2right非光谱法包含物质内能的变化，即不涉及能级跃迁，而是基于物质所引起的辐射方向和物理性质的改变。（如折射、反射、色散、干涉、衍射及偏振等现象）复合光经过色散系统（如棱镜或者光栅）分光后，按照波长（或频率）的大小以次排列的图案称为光谱。光谱的产生是由于物质的分子、原子或者离子受到外部
2、能量的作用后，其内部的运动状态会发生变化，即能级变化。变化的能量以电磁辐射的形式释放或吸收。因此，光谱可以分为发射光谱和吸收光谱两大类。checkbld吸收光谱当辐射通过气态、液态或透明的固态物质时，物质的原子、离子或分子将吸收与其内能变化相对应的频率辐射，由低能态或者基态跃迁到较高的能态。这种由于物质对辐射的选择性吸收而得到的光谱，称为吸收光谱。checkbld发射光谱处于高能级的原子或分子在向较低能级跃迁时产生辐射，将多余的能量发射出去形成的光谱xrhombus 当原子受到外界因素的激发时电子吸收一定的能量而跃入其g3408能量较高的可能g1701g1281g3176去，这时电子g994g
3、3639定g3409能g4497发g1305g3499跃到较低能级的可能g1701g1281g3176g969发出一g1617光子，g1206g994g3517的能量较高的可能g1701g1281g3176g3499跃到g3517一能量较低的可能g1701g1281g3176g2303时g3406发出的谱g3756g3055g3307于g3517一g3756系。xrhombus 大量处于激发态的原子会发出g1618g994相g3517的谱g3756g4518成g2420g3007原子光谱的g3046部谱g3756，由于产生的g3014g2275g994g3517，发射光谱g4123可分为g23
4、89g3875光谱和明g3756光谱（g20）g3694g874气g3480发光是由g994g2389g3875的g2410g3756g4518成，这种发射光谱g4123g2049g4531明g3756光谱g15xrhombus原子产生的明g3756光谱g3993g2049g4531原子光谱。xrhombus （g21）固g3480或液g3480g1923高g3906气g3480的发射光谱，是由g2389g3875分g995的波长的光g4518成的，这种光谱g4531g2389g3875光谱。xrhombus g2376如电g1287g3348发出的光、g1128g3075的g1585g333
5、1发出的光g1371形成g2389g3875光谱g3467g4344性质 g4014g2934g1466g1445光谱g1445辐射的发射辐射的吸收原子发射光谱法、原子荧光光谱法、X射线荧光光谱法、分子荧光光谱法、分子磷光光谱法、化学发光法、电子能谱法原子吸收光谱法、紫外可见分光光度法、红外光谱法、X射线吸收光谱法、核磁共振波谱法辐射的散射 拉曼光谱法g1476光谱g1445辐射的散射辐射的g4316射辐射的g3941射辐射的g4455动g913g4484g1445、散射g4484g1383g1445g4316射g1445、g1572g3199g1445g59射g3756g3941射g1445
6、、电子g3941射g1445g3880光色散g1445、g2858g4338g1445、g4181g1437色g1445光谱分析一、紫外可见光谱二、原子吸收光谱三、原子发射光谱四、红外光谱紫外可见光谱法周宏敏常用光谱分析法分类电磁波与分子能级变化A:g4455动能级跃迁（g4185g1795外g3029）B:g4455动/g4338动能级跃迁（g2093g1795外g3029）C:g4455动/g4338动/电子能级跃迁g3029（可g1998、g4492外g3029）xrhombus 一般原子对电磁辐射的吸收只涉及原子核外电子能量的变化，是一些分离的特征锐线，而分子的吸收光谱是由成千上万条彼
7、此靠得很紧的谱线组成，看起来是一条连续的吸收带。紫外-可见吸收光谱法概述xrhombus 分子的紫外-可见吸收光谱法是基于分子内电子跃迁产生的吸收光谱进行分析的一种常用的光谱分析法。分子在紫外-可见区的吸收与其电子结构紧密相关。生色团对分子紫外吸收的影响胆甾酮（a）与异亚丙基丙酮（b）分子结构差异很大，但两者具有相似的紫外吸收峰。两分子中相同的O=C-C=C共轭结构是产生紫外吸收的关键基团。生色团 化合物例 g80g68g91 (nm) g80g68g91 跃迁类型 溶剂 R-CH=CH-R(烯) 乙烯 165 15,000 pi pig13 气体 R-CoC-R(炔) 辛炔-2 195 21
8、,000 pi pig13 庚烷 R-CO-R(酮) 丙酮 189 900 n g13 正己烷 R-CHO(醛) 乙醛 180 10,000 n g13 气体 R-COOH(羧酸) 乙酸 208 32 n pig13 95%乙醇 R-CONHg21(酰胺) 乙酰胺 220 63 n pig13 水 部分生色基团及其相应化合物的吸收特性R-NOg21(硝基化合物) 硝基甲烷 201 5,000 甲醇 R-CN(腈) 乙腈 338 126 n pig13 四氯乙烷 R-ONOg21 (硝酸酯) 硝酸乙烷 270 12 n pig13 二氧六环 R-ONO(亚硝酸酯) 亚硝酸戊烷 218.5 1,1
9、20 pi pig13 石油醚 R-NO (亚硝基化合物) 亚硝基丁烷 300 100 乙醇 R-N=N-R(重氮化合物) 重氮甲烷 338 4 pi pig13 95%乙醇 R-SO-R(亚砜) 环己基甲基亚砜 210 1,500 乙醇 R-SOg21-R(砜) 二甲基砜 180 有些基团本身在200 nm以上不产生吸收，但这些基团的存在能增强生色团的生色能力（改变分子的吸收位置和增加吸收强度），这类基团称为助色团(auxochrome)。一般助色团为具有孤对电子的基团，如-OH, -NH2, -SH等。含有生色团或生色团与助色团的分子在紫外光区有吸收并伴随分子本身电子能级的跃迁，不同官能团
10、吸收不同波长的光。作波长扫描，记录吸光度对波长的变化曲线，就得到该物质的紫外-可见吸收光谱。head2right 电荷转移吸收当外来辐射照射某些有机或无机化合物时,可能发生一个电子从体系具有电子给予体特性部分转移到该体系的另一具有电子接受体特性的部分。这种电子转移产生的吸收谱带，称为电荷转移吸收带。Feg21g14是电子给体-苯环是电子受体 -NRg21是电子给体-苯环是电子受体 苯环是电子给体-氧是电子受体 电荷转移吸收带的一个特点是吸收强度大，因此含有这类结构的分子测定灵敏度高，该原理已被广泛应用于分子识别的主体分子设计中。影响紫外-可见吸收光谱的因素红移、蓝移、增色、减色示意图谱带位移:
11、 红移指吸收峰向长波长移动蓝移指吸收峰向短波长移动吸收峰强度: 增色效应指吸收强度增加减色效应指吸收强度减小影响紫外-可见吸收光谱的因素xrhombus 电子共轭体系增大，max红移，max增大。xrhombus 由于共轭效应，电子离域到多个原子之间，导致跃迁能量降低，同时跃迁几率增大。共轭效应使跃迁轨道能量降低xrhombus 空间阻碍使共轭体系破坏max蓝移，max减小。xrhombus 取代基越大,分子共平面性越差，因此最大吸收波长蓝移，摩尔吸光系数降低。影响紫外-可见吸收光谱的因素g2242g1975g4517g792g3248g1643g6210g3480系g2885g1834g56
12、1g80g68g91g2305g4013，g555g80g68g91g1992小。xrhombus 取代基的影响xrhombus 共轭体系中引入吸电子基团，也产生电子的永久性转移， max红移。电子流动性增加，吸收光子的吸收分数增加，吸收强度增加。给电子基与吸电子基同时存在时，产生分子内电荷转移吸收， max红移， max增加。xrhombus 溶剂的影响紫外-可见分光光度计光源常用的光源有热辐射光源和气体放电光源。利用固体灯丝材料高温放热产生的辐射作为光源的是热辐射光源。如钨灯、卤钨灯。两者均在可见区使用,卤钨灯的紫外-可见分光光度计使用寿命及发光效率高于钨灯。气体放电光源是指在低压直流电条
13、件下,氢或氘气放电所产生的连续辐射。一般为氢灯或氘灯,在紫外区使用。单色器xrhombus 单色器的作用是使光源发出的光变成所需要的单色光。xrhombus 两种方式：光栅和棱镜。紫外-可见分光光度计光栅棱镜紫外-可见分光光度计xrhombus 吸收池用于盛放试液。石英池用于紫外-可见区的测量，玻璃池只用于可见区。xrhombus 检测器简易分光光度计上使用光电池或光电管作为检测器。目前最常见的检测器是光电倍增管，有的用二极管阵列作为检测器。xrhombus 双波长紫外-可见分光光度计xrhombus 双光束紫外-可见分光光度计分光光度测定方法head2right 分光光度滴定以一定的标准溶液
14、滴定待测物溶液，测定滴定中溶液的吸光度变化，通过作图法求得滴定终点，从而计算待测组分含量的方法称为分光光度滴定。悬浊液和悬浮液的测定，消head2right 双波长分光光度法它g3262通过g2406个g1254g3140g2934分g953g2012光g4183g1439g1147的光分g11021 g992g2406g3311g1254g3140光，g2108g4279光g2934g969g3311g1802g2028g3481通过同一吸收g1117。因此g1983测的g3262g3275g3970溶液g1395g2406波长光吸收g1802的吸光度差。g1154g892g2111吸收g3
15、661g3862分离。吸收g1506g3757g1818g4407g1343的g1889g1766组分的同时测定。标准曲线法分光光度测定方法xrhombus 配制不同浓度的标准溶液，由低浓度至高浓度依次测定其吸收光谱，作一定波长下浓度与吸光度的关系曲线，在一定范围内应得到通过原点的直线，即标准曲线。通过标准曲线可求得g3619g4361g3970g2870的浓度。xrhombus 标准g1958g3110g1445分光光度测定方法由加入待测g3275g3970g2761度由低g4384g1594g4007g1201测定g3176g3309溶液的吸收光g2902，作一定波长g3727g2761度与吸光度的g1681系g3031g3756，得到一g3496g4368g3756。g3119g4368g3756通过原点，g4245g3970g2870中g994含待测组分g290g3119g994通过原点，g2012g4368g3756在g4506g4416g3176的g2057g2159g3932长与g1784g4416g3757g2028，g2028点离g2199原点的g2159离为g3970g2870中待测组分的g2761度。分子荧光、磷光和化学发光g4080光g99g2432光和g1828g3888发光分g36
