【最新】肝糖原的提取、鉴定与定量

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1、生物化学实验报告姓 名： 汪煜灵 学 号： 3130010071 专业年级： 2013 级临床医学 组 别： 第 2 实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称 肝糖原的提取、鉴定、分离实验日期 2014-12-25 实验地点 第 2 实验室合作者 陈海玲 指导老师 朱利娜评分 教师签名 批改日期1、实验目的1、掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。3、正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。4、熟练运用溶液混匀的各种方法。5、正确掌握溶液转移的操作。6、正确操作使用分光光度计。2、实验原理 肝糖

2、原的提取糖原储存于细胞内，采用淹没匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使糖原与蛋白质等其他成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用 95%乙醇将绿叶中糖原沉淀，再溶于热水中。 糖原的鉴定糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的的存在。CuSO4 + 2NaOH = Na2SO4 + Cu(OH)22Cu(OH)2 + C6H12O6 = 2CuOH + 氧化型葡萄

3、糖 + H 2O2CuOH = H20 + Cu2O (红色)Cu(OH)2 = H2O + CuO (黑色) 肝糖原的定量糖原在浓酸中可水解为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在 620nm 处有最大吸收。糖含量在 10100mg 范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量的标准溶液比色，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，而保留肝糖原。3、实验材料 仪器：1、普通离心机，室温-100恒温

4、水浴箱（x2），722 型分光光度计，精度为 10mg 级电子天平2、剪刀、镊子、研钵3、试管架，离心管，试管4、刻度吸量管（2ml ,5ml），1000l 微量可调取液器5、100ml 容量瓶6、白瓷反应板 试剂：鸡肝、95%乙醇、0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、浓HCl、12.5mol/L(50%)NaOH、碘试剂、班氏试剂、30%KOH 溶液、标准葡萄糖液（50mg/L）蒽酮显色剂4、实验步骤 肝糖原的提取鸡肝约 1.5g，剪碎研磨至乳状研磨成肝匀浆全部转入离心管中，离心 3min（4000r/min）取上清液离心 5min（4000r/min

5、）取沉淀沸水浴 2min，溶解沉淀糖原溶液 1ml 白瓷板中沸水浴加热 15min，冷却加碘试剂 0.1ml 加碘试剂 0.1ml糖原溶液 0.1ml糖原水解液 0.1ml（2d） 糖原水解液呈色对比混匀沸水浴 2min，观察变化 注意事项：+5ml 95%乙醇，混匀，静置 10min+5%CCl3COOH 1ml+5%CCl3COOH 3ml+蒸馏水 2ml+50% NaOH 0.2ml+班氏试剂 0.2ml(4d)+浓 HCl 0.2ml1、提取肝糖原时，向上清液中加入等量的 95%乙醇后，必须混匀。由于上清液为水溶液，比重大于 95%乙醇，溶液分成两层。加之上清液已 4ml 多，加上等量

6、乙醇，总量接近 9ml，混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。2、糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残基在 20 个以下的会使碘呈现红色，20-30 个之间使碘呈现紫色，60 个以上的会使碘呈现蓝色。淀粉中分支链较长，故呈蓝色，而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在 20 个以下（通常 8-12 个葡萄糖残基），吸附碘后呈现红棕色。3、糖原水解液中鉴定葡萄糖时，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。 肝糖原定量测定鸡肝 0.15 g沸水浴 15min冷却，全部转入 100ml 容量瓶中加水至标线，仔细混匀，获得糖原提取液取 3 支干

7、净的试管，按下表操作：试剂（ml） 空白管 标准管 样品管蒸馏水 1.0 标准葡萄糖溶液 1.0 糖原提取液 1.00.2%蒽酮溶液 2.5 2.5 2.5混匀，沸水浴 10min，冷却。在 722 型或 721 型分光光度计 620nm 波长处，用空白管溶液调零，测定各管溶液的吸光度（A）.计算：肝糖原（g/100g 肝组织）= X 0.05 X X X 1.11标 准测 定A）肝 组 织 重 （ g1010+30% KOH 1.5ml5、实验现象与结果讨论 糖原水解液加班氏试剂沸水浴后无明显变化。 糖原溶液加碘试剂后呈红棕色，但与碘试剂原来颜色区别不大。 鸡肝加碱沸水浴后分层，上层为红棕色

8、，下层无色。 加入蒽酮溶液并且水浴过后的空白管、标准管、样品管（由左至右）对比 将空白管在 620nm 处的 A 值设定为 0，测得标准管、样品管的 A 值如下：空白管 标准管 样品管1 0 0.610 0.0852 0 0.612 0.0853 0 0.616 0.091平均值 0 0.613 0.087肝糖原（g/100g 肝组织）= X 0.05 X X X 1.11标 准测 定A）肝 组 织 重 （ g10100.525从肝糖原的定量试验中可知鸡肝样品中含有糖原，但在定性实验中结果不明显，可判断实验所采用的鸡肝样品含糖原量比较少，造成鸡肝糖原量少的原因可能是用于实验的鸡处于饥饿状态，糖原分解以维持血糖稳定，因此使肝中剩余的糖原量少于非饥饿状态下的鸡的肝糖原含量。