色谱分析医学课件

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1、第十八章色谱分析技术和色谱分析仪器 色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用 他在研究植物叶的色素成分时 将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内 然后加入石油醚使其自由流下 结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带 这种方法因此得名为色谱法 以后此法逐渐应用于无色物质的分离 色谱 二字虽已失去原来的含义 但仍被人们沿用至今 英国生物学家Martin和Synge 他们首先提出了色谱塔板理论 发明分配色谱 1952年获诺贝尔化学奖 1944年出现纸色谱以后 色谱法不断发展 相继出现薄层色谱 亲和色谱 凝胶色谱 气相色谱 高压液相色谱 HPLC 等 20世纪50年代气

2、液色谱的创立和发展具有划时代的意义 催生了许多现代色谱方法 色谱法 chromatography 是一种物理分离技术 实质上是利用混合物中各个组分在互不相溶的两相 固定相和流动相 之间的分配的差异而使混合物得到分离的一种方法 也有人称之为色层法 层析法等 第一节色谱法概述 引言 色谱仪 chromatograph 的实质是利用色谱分离技术再加上检测技术 对混合物进行先分离后检测 从而实现对多组分的复杂混合物进行定性 定量分析 在色谱法中 将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相 固体或液体 称为固定相 自上而下运动的一相 一般是气体或液体 称为流动相 装有固定相的管子 玻璃管或不锈钢管 称为色谱

3、柱 色谱分离中的两相是指系统具有一个有大比表面积的固定相 stationaryphase 可以是固体或以某种方式固定了的液体 和一个能携带待分离混合物流过固定相的所谓流动相 mobilephase 可以是气体或液体 色谱工作就是根据被测样品 混合物 的性质 选择适当的两相和其他操作条件 利用分离系统将各个组分分离开来 通过检测系统进行定性 定量分析 具有高分辨率 高灵敏度 样品量少且速度较快 结果准确等优点 是分析混合物的有效方法 色谱分析的基本原理 色谱是利用待分离的样品组分在两相中分配的差异而实现分离的 色谱法是一种分离 分析方法 有时又称为层析技术 它利用被分离的诸物质在互不相溶的两相中

4、分配系数等的微小差异进行分离 当两相作相对移动时 使被测物质在两相之间进行反复多次分配 使原来微小的差异累加产生了很大的效果 形成差速迁移 使各组分在柱内移动的同时逐渐分离 以达到分离 分析及测定一些物理化学常数的目的 两种组分的理化性质原本存在着微小的差异 经过反复多次地吸附 解吸 再吸附 再解吸的过程使微小差异累积起来 结果使吸附能力弱的组分先流出色谱柱 吸附能力强的组分后流出色谱柱 从而使各个组分得到了分离 吸附 解吸 再吸附 再解吸 色谱过程 图5 1色谱分离原理示意图 由此可见 色谱分离的两要素是互不相溶的两相 流动相及固定相 以及样品 混合物 各组分在两相中分配的差异 它是决定色谱

5、最终分离结果好坏的基础 色谱法的特点 1 分离效率高 可在很短的时间内分离多达二 三百个组分的复杂物质 柱效能可达106的理论板 2 检测能力强 可以检测出10 11 10 15克级的痕量组分 能满足环境检测 农药残留等大量日常检测分析的需要 3 样品用量少 样品用量一般为微升级 少的可达纳克级 4 适用范围广 几乎所有与化学有关的领域都有其用武之地 色谱技术的分类 1 按两相状态分类气体为流动相的色谱称为气相色谱 GC 根据固定相是固体吸附剂还是固定液 附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体 又可分为气固色谱 GSC 和气液色谱 GLC 液体为流动相的色谱称液相色谱 LC 同理液相色谱亦可分

6、为液固色谱 LSC 和液液色谱 LLC 超临界流体为流动相的色谱为超临界流体色谱 SFC 随着色谱工作的发展 通过化学反应将固定液键合到载体表面 这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱 CBPC 2 按分离机理分类利用组分在吸附剂 固定相 上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法 称为吸附色谱法 利用组分在固定液 固定相 中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法 利用组分在离子交换剂 固定相 上的亲和力大小不同而达到分离的方法 称为离子交换色谱法 利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法 称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法 最近 又有一种新分离技术 利用不同组分与固定相 固定化

7、分子 的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法 常用于蛋白质的分离 3 按固定相的外型分类固定相装于柱内的色谱法 称为柱色谱 固定相呈平板状的色谱 称为平板色谱 它又可分为薄层色谱和纸色谱 4 按照展开程序分类按照展开程序的不同 可将色谱法分为洗脱法 顶替法 和前沿法 与光谱仪 质谱仪等分析仪器相比较 色谱仪的突出优点是对多组分混合物分离 分析能力较强 其分析灵敏度与质谱仪接近 比光谱仪高 而且造价低 使用方便 色谱仪最大的不足之处是难于分析未知物 因此 可以将其与光谱仪 质谱仪联合起来使用 优势互补 形成色谱 光谱法 色谱 质谱法联用技术 再配备上微机进行自动控制与信息处理 多机联用与微

8、机化 自动化是现代分析仪器发展的重要趋势 1 色谱图 chromatogram 表明已被色谱柱分离的物质流过检测器的含量与时间的关系 色谱流出曲线及有关术语 2 基线 baseline 是图中与时间轴平行t的记录线b 它表明纯流动相流过检测器时所产生的响应 判断基线稳定与否的标准是基线稳定性 即基线b与时间轴t平行或偏离的程度 色谱流出曲线和色谱峰基线 a 峰高 h 3 色谱峰检测器的输出信号随流入组分的浓度或质量的变化出一个个的峰形 即为色谱峰 chromatographicpeak 色谱峰所包围的面积称为峰面积 是色谱定量分析的基础 色谱峰最高点至峰底的垂直距离称为峰高 peakheigh

9、t h 色谱流出曲线和色谱峰基线 a 峰高 h 进样峰 injectionpeak 是进样时操作条件被干扰出现的 也可在进样时通过连动装置进行标记 是色谱分离过程中时间的起点 空气峰 airpeak 是由于空气等物质不被固定相吸收 最先被流动相冲洗出来到达检测器而形成的峰形 4 保留时间从进样开始到出现色谱峰最大值所需的时间为保留时间 re tentiontime 常用tR 组分名 或简写为tR 表示 如tR1 tR2等 单位为min 与保留时间有关的其他参数 如保留体积 校正保留时间等 统称保留参数 5 死时间死时间 deadtime 是指惰性物质组分 从注入到出现峰的最高点所需时间 若组分

10、是空气 用符号t0表示 单位为min 死体积 deadvolume 指色谱柱内流动相的体积 在实际中包括从进样系统到检测器的体积 因为这种物质不被固定相吸附或溶解 故其流动速度将与流动相流动速度相近 测定流动相平均线速 时 可用柱长L与tM的比值计算 某组分的保留时间扣除死时间后 称为该组分的调整保留时间 即tR tR tM由于组分在色谱柱中的保留时间tR包含了组分随流动相通过柱子所需的时间和组分在固定相中滞留所须的时间 所以tR实际上是组分在固定相中保留的总时间 保留时间是色谱法定性的基本依据 但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响 因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值 6调整保留时

11、间tR 7死体积V0指色谱柱在填充后 柱管内固定相颗粒间所剩留的空间 色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和 当后两项很小可忽略不计时 死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速Fco cm3 min 1 计算 V0 tMFco式中Fco为扣除饱和水蒸气压并经温度校正的流速 仅适用于气相色谱 不适用于液相色谱 8保留体积VR指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积 保留时间与保留体积关系 VR tRFco 调整保留体积VR 某组分的保留体积扣除死体积后 称为该组分的调整保留体积 VR VR V0 tR Fco 9区域宽度色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之

12、一 用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素 表示色谱峰区域宽度通常有三种方法 1 标准偏差 即0 607倍峰高处色谱峰宽的一半 2 半峰宽Y1 2 即峰高一半处对应的峰宽 它与标准偏差的关系为Y1 2 2 354 3 峰底宽度Y 即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离 它与标准偏差 的关系是Y 4 从色谱流出曲线中 可得许多重要信息 i 根据色谱峰的个数 可以判断样品中所含组分的最少个数 ii 根据色谱峰的保留值 可以进行定性分析 iii 根据色谱峰的面积或峰高 可以进行定量分析 iv 色谱峰的保留值及其区域宽度 是评价色谱柱分离效能的依据 v 色谱峰两峰间的距离 是评价固定相 或

13、流动相 选择是否合适的依据 色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离 组分要达到完全分离 两峰间的距离必须足够远 两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的 即与色谱过程的热力学性质有关 但是两峰间虽有一定距离 如果每个峰都很宽 以致彼此重叠 还是不能分开 这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的 即与色谱过程的动力学性质有关 因此 要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为 五 色谱技术在临床检验中的应用气相色谱仪常用于人体微量元素的快速分析 血与尿等体液中的脂肪酸 氨基酸 甘油三酸酯 甾族化合物 糖类 蛋白质 维生素 巴比妥酸等化合物的分析 分析鉴定药物的组成和含量 检测人体的代谢

14、产物 通过气相色谱仪串联质谱 在 兴奋剂 检测中可分析100余种违禁药品等 高效液相色谱仪可以应用在 分析人体体液内正常与异常代谢物质 分析药物的组成和含量 在药物生产中进行中间控制 分析药物在体内的残留量 测定药物在各器官中的代谢产物 进行治疗药物效果的监测 治疗药物检测 定性测定细胞核中的核苷及核苷酸 分析核酸以及分析氨基酸 酶 糖 激素水平的测定 微生物的鉴定等 气相色谱法的特点优点 分离效率高 应用范围宽 分析速度快 样品用量少 灵敏度高 分离和测定一次完成 自动化程度高 缺点 不适用于高沸点 450 有生物活性的物质的分离测定不适用于制备 第二节气相色谱仪 待测样品在高温的气化室气化

15、后在惰性气体的带动下进入色谱柱 色谱柱内含有液体或固体固定相每种组分都倾向于在流动相和固定相之间形成分配或吸附平衡 但由于载气是流动的 这种平衡实际上很难建立 由于载气的流动 使样品组分在运动中进行反复多次的分配或吸附 解吸 结果是在载气中分配浓度大的组分先流出色谱柱 而在固定相中分配浓度大的组分后流出色谱柱 进入检测器 甲醇和乙醇混合样色谱图 国产气相色谱仪 国外产气相色谱仪 一台典型的气相色谱仪主要由气路系统 进样系统 分离系统 色谱柱 检测系统 温度控制系统 数据处理 记录系统及电源 电子线路等构成 一 气路系统气相色谱仪的气路系统通常由载气源 减压阀 净化器 稳压阀 稳流阀 柱子及全部

16、连接管道构成 气路系统的目的是向色谱柱提供质地洁净 流动平稳的流动相 二 进样系统进样系统由载气预热器 取样器 样品分流器和进样气化装置等组成 进样系统的要求一方面是准确定量 迅速注入 另一方面气态或经气化的样品能在载气中形成一个窄带集中地进入色谱柱 否则测量结果将毫无意义 三 气相色谱柱及温度控制 一 气相色谱柱1 固定相整个气相色谱系统的核心是分析柱 混合物各个组分的分离就是在此完成 在使用气相色谱仪的过程中 优良的柱子应该具有适当的尺寸和适当的固定相 一般说来 非极性液态固定相最适于分离链烷烃之类的非极性混合物 而极性固定相最好是分离极性化合物 如醇或酚等 在气固色谱中 常选用的填充吸附剂主要有强极性的硅胶 中等极性的氧化铝 非极性的活性炭以及分子筛等 2 柱管形状和尺寸柱管形状一般有三种 即U型管 盘形管和螺线管 其中以U型管最常用 柱子的尺寸应对容量 样品量 和分析速度最佳化 为获得最大效率 可用内径较小 长度较长的毛细管柱 当分析的样品量较大且分离不困难时 可用内径较大 长度较短的填充柱 二 温度控制气态样品决定了必须进行温度操作 首先 温度对于固定相十分重要 操作时一定要