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1、杜克文 学号 0904014114 水产养殖(1)班细胞松弛素 B 在诱导中国对虾三倍体上的应用摘要：中国对虾的受精卵可以通过细胞松弛素 B 的作用达到三倍体，一些三倍体生物可以被培养到蚤状幼体阶段。细胞松弛素 B 的浓度一般控制在 0.1-2.5dm/dm3,处理时间为 10-40min,最大诱导率为 62.5%。很明显的，细胞松弛素 B 浓度越高，对极体溶解的抑制作用越强，并且细胞松弛素 B 的浓度越高，变异性和非整倍的极体数目越多。中国对虾的诱导三倍体的试验成功为多倍体育种提供了可能。如今在遗传学的研究和基因育种方面，水生生物的人工诱导多倍体越来越受到重视。三倍体个体高度不育，但是有个体
2、大，生长快，质量好，存活率高等许多优良性状。自从 20 世纪 70 年代以来，被诱导产生的多倍体鱼种已经达到了 20 多种。软体动物的多倍体诱导开始于 19 世纪 80 年代，并且进展迅速。在过去的几年里，已经有大约 10 种软体动物被诱导成多倍体。以中国对虾为例，雄性个体比雌性个体成熟早，这也直接导致雄性个体的生长速度，体长和体重方面与雌性个体有很大的不同。一般来说，雄性对虾在秋季达到性成熟，并且大部分个体在交配后变得筋疲力尽。为了在生殖季节抑制生殖腺的成熟，培育大规格的对虾个体和提高其存活率，人们开始对中国对虾进行多倍体诱导实验。迄今为止，还没有关于多倍体诱导明虾的实验报道，但现在报纸报道
3、了中国对虾的多倍体诱导的实验结果。材料对于用来诱导多倍体的中国对虾主要来源于山东省的金口，即墨市，清香阁和长流镇，并在其中选取完全性成熟的健康雌性个体。细胞松弛素 B 从sigma 公司购买。把细胞松弛素 B 粉溶入含有 0.01%DMSO 的干净海水中，分别配成浓度为 2.5dm/dm3,1.0dm/dm3,0.5dm/dm3,0.1dm/dm3 和 0.05dm/dm3的试剂。当受精后 5min,10min,15min 和 20min，才开始对受精卵用细胞松弛素 B 处理。实验组分别被处理时间为 10，20，30，40 和 45min，当完成上述步骤后，用移液管把细胞松弛素 B 吸出来，并
4、用 0.01%DMSO 海水溶液洗涤受精卵两次。每次洗涤 8-100min 不等，对照组只用 DMSO 液洗涤，每个实验组大约含有500 个受精卵，放在干净的海水里，并置于一个大气压，18-20的培养箱中培养，注意要控制细胞松弛素 B 的浓度为 0.1dm/dm3,作用 20min。每组受精卵样本培育大约需要 12h，但是浓度大的样本被诱导多倍体可以达到无节幼体和蚤状幼体阶段。并用 3：1 乙醇- 乙酸液处理。对染色体的准备方法和以前的报道一样。然后进行细胞观察，染色体计数，从而评估细胞松弛素 B 对极体溶解的影响情况。不同浓度的细胞松弛素 B 对极体溶解的影响也不同。当细胞松弛素 B浓度升高
5、时，极体的溶解数目降低，处理时间越长，极体溶解的数目也越少。但是细胞松弛素 B 只有作用时间达到 10min，才会抑制极体的溶解。受精卵在细胞松弛素 B 处理 10min 后才会开始影响其溶解。当用 0.8dm/dm3的细胞松弛素 B 作用 40min 后，极体几乎全部消失。30min 后，在 0.5dm/dm3和 1.0dm/dm3的实验组中，许多受精卵的膜变得松弛，细胞浆凝固，细胞膜结构突出，从而导致浆液溢出细胞并形成卵裂体。这种成形的变异分裂体和分裂球体有时到达受精卵表面。在用细胞松弛素 B 处理10h 后方可观察到各组细胞的不同点。在 0.1dm/dm3的实验组中几乎找不到正常分裂的细
6、胞，而在 1.0dm/dm3的实验组大约有一半细胞是正常分裂的。如果细胞松弛素 B 浓度上升到 2.5dm/dm3，细胞分裂被强烈一直，细胞膜变得脆弱破裂并最终死亡，只有一小部分可以正常分裂。染色体的计数中国对虾染色体的研究已经得到了报道。正常为 2n=88,而三倍体个体为3n=132.结果显示有效刺激浓度为 1.0dm/dm3并持续 5-10min。三倍体细胞占整个胚胎细胞数的 62.5%，0.05dm/dm 3的实验组无三倍体出现。在处理的受精卵中，有三倍体，二倍体还有一些非整倍体细胞。并随着细胞松弛素 B 浓度的增加，其非整倍体细胞也随着增加。在高浓度细胞松弛素 B 作用的实验组中，一些
7、无节幼体和蚤状幼体也被三倍体化。讨论细胞松弛素 B 处理可以增加变异度，并降低像晋江牡蛎，沙海螂，马氏水母贝等软体动物的受精卵的存活率。人们培养中国对虾的受精卵后发现其极体溶解发生了抑制。并且细胞松弛素 B 浓度越高，非整体染色体和变异胎盘数目也变大。受精卵，孵化率和胎盘发育受许多因素的影响。Allen 认为细胞松弛素 B 导致的变异细胞分裂是五月份非整倍体细胞存活率低的原因所在，而其他人则认为受精卵的成熟程度，雌性亲本的生活状态和实验的环境因素影响其存活率。根据对中国对虾的研究结果，当细胞松弛素 B 升高，变异胎盘的数目也随着增加，但孵化率却降低。所以，我们相信细胞松弛素 B 是最重要的影响
8、因素。但是在实验过程中，对照组的受精卵却出现孵化率低和变异率高等特点。由此可见，外界环境因素和受精卵的发育程度也是多倍体诱导时不可忽视的条件。所以，怎样提高受精卵，孵化率，怎样减少变异胎盘的数目是现在棘手的问题。在这个领域，还需要进行更深层次的研究，来找出其他影响多倍体胚胎存活率的因素。Dowming 和 Allen 认为，在诱导多倍体方面，细胞松弛素 B 比物理因素更有效。因为它抑制纺锤丝和网系统的形成，所以细胞分裂可以被抑制而核分裂却不受到任何影响。同时，温度和压强也可以抑制微丝和微管的形成。它们不仅抑制细胞分裂，也阻止染色体的活动。因此，用温度，压强作用肯那个阻止其整个生命活动。结果表明
9、，热振动的最大诱导率为 43.75%，远低于细胞松弛素 B 的诱导水平，这种结果和蒋纬国和 Wada 的实验结果一致。但是 Gosling 和 Nolan 的实验却得出了相反的结论：热冲击的最大诱导率为 55%，而细胞松弛素 B 的为 50%。结论表明在明虾的人工诱导多倍体中，其最有效的诱导因子，强度大小，开始作用时间和持续时间都是应该进一步研究的。科学家们已经用物理化学因素作用于鱼类和软体动物的人工诱导多倍体的试验中。中国对虾的诱导成功被第一次记录下来。三倍体动物高度不育，用于生殖腺发育的营养和能量也同样用于个体生长。因此，大规格明虾也可以培养获得。除此之外，在出塘期，三倍体生物的死亡率也比较低，这有利于人们获得良好的经济效益
