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1、1载脂蛋白 A5 SNP3、4 基因变异与冠心病的相关性作者：韩彤亮 蔡湘丽 李梅 宋达琳 赵仲堂 康维强 【摘要 】 目的探讨冠心病病人载脂蛋白 (Apo)A5 基因变异与冠心病及其脂代谢异常的相关性，并分析其在冠心病发病机制中的作用。方法随机选择非亲属山东汉族冠心病及其脂代谢异常病人 275例(冠心病组) ，以年龄和性别相匹配的正常人 289 例作为对照组，采用聚合酶链反应-限制性内切酶片断长度多态性分析，结合全自动测序技术，检测两组 ApoA5 SNP3、SNP4 位点基因型，同时检测血脂水平。结果经 Logistic 回归分析校正，冠心病组 SNP3 位点TC 基因型与对照组比较差异有
2、显著性(2=4.08，P0.05)，且为独立影响因素。ApoA5 SNP3 与 ApoC3-482C/T 基因间的连锁不平衡与对照组比较具有一定的差异。冠心病组 SNP3 TC 基因型三酰甘油水平明显高于其他两种基因型(F=7.56，q=4.69、4.32，P0.05)。结论 SNP3 与冠心病的遗传易感性相关;SNP4 通过影响血脂代谢水平增加冠心病的易感性;单倍体优势是冠心病遗传易感性的重要因素之一。 【关键词】 冠状动脉疾病;血脂异常;载脂蛋白 A 类;基因型 ABSTRACTObjectiveTo study the correlation of genovariation of ap
3、olipoprotein A5 (Apo) with coronary artery disease (CAD) and its abnormal lipid 2metabolism.MethodsThe present study consisted of 275 CAD patients with abnormal lipid metabolism, who were selected in random from non-relatives of Han people of Shandong province; and 289 healthy subjects matching with
4、 age and gender served as controls. The gene variation of apolipoprotein series including ApoA5 SNP3 and SNP4 were identified by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism and DNA sequence,and plasma lipid levels measured as well.ResultsAfter Logistic regression analysis, the
5、 frequency of ApoA5 SNP3 TC in the patients was significantly higher than that of the control group (2=4.08,P0.05), which was a independent influencing factor. The strong linkage disequilibrium was reflected between ApoA5 SNP3 and ApoC3-482C/T in CAD group. In CAD patients, the levels of triglycerid
6、e (TG) were significantly higher in ApoA5 SNP3 TC compared with the other two genotypes (F=7.56;q=4.69,4.32;P0.05).ConclusionApoA5 SNP3 is associated with genetic predisposition of CAD, and SNP4 increases the susceptibility of CAD through effecting lipid metabolism. The haploid dominance is one of i
7、mportant factors of genetic predisposition of CAD. KEY WORDScoronary disease; dyslipidemias; 3apolipoproteins; genotype 脂蛋白代谢异常是动脉粥样硬化发生的最主要原因1。研究显示，载脂蛋白(Apo)基因变异可能与冠心病及其脂代谢异常相关2 ，ApoA5 是新近发现的血脂代谢的主要调节基因，但有关 ApoA5 基因多态性变异与高脂血症和动脉硬化的关系，尤其在冠心病的发生、发展中意义尚无定论3-4。本研究通过病例对照研究，观察山东沿海汉族人群 ApoA5 基因多态性对冠心病以及脂代
8、谢的影响。现将结果报告如下。 1 对象与方法 1.1 研究对象 冠心病组病人均为山东沿海非亲属关系汉族人群，经冠状动脉造影证实为冠心病病人，共 275 例，男 155 例，女 120 例;年龄4871 岁，平均(59.29.8) 岁;其中稳定型心绞痛 126 例，不稳定型心绞痛 87 例，陈旧性心肌梗死 62 例; 并高血压 68 例，高脂血症92 例。以连续 3 年体检血脂、肝肾功能等各项检测指标正常，无既往冠心病史的 289 例健康人作为对照组，男 163 例，女 126 例;年龄 5069 岁，平均(61.610.7)岁。所有研究对象均排除其他系统疾病。两组性别和年龄比较差异无显著性。
9、1.2 方法 1.2.1 血标本采集两组( 冠心病组于停服降脂药物 1 周后)取空腹静脉血 3 mL，EDTA 抗凝备用。 1.2.2 基因型检测参照文献4设计合成引物， ApoA5 SNP34上游引物序列 5-GATTGATTCAA-GATGCATTTAGGAC-3,下游引物序列 5-CCCC-AGGAACTGGAGCGAAATT-3;SNP4 上游引物序列 5-GTGCCTGTCACCACCGTTTGG-3,下游引物序列 5-ATGCATTAGCCTCTGCTGTTG-3,引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;采用美国 Promaga 公司全血提取基因组 DNA试剂盒提取基因组 D
10、NA，经定量后稀释至 20 g/L 备用。在美国STRATAGENE 系列定量 PCR 仪上进行 PCR 反应，反应体积为 20 L，含 DNA 40 ng，上下游引物均为 0.2 mol/L, 200 mol/L 的各种 dNTP,0.5 U 的 Taq DNA 聚合酶和 PCR 缓冲液。反应条件为：首先 96 预变性 2 min;然后 94 变性 15 s、退火 40 s，72 延伸 20 s，共进行 30 个循环 ;最后 72 延伸 10 min。RFLP 分析以及测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，测序仪为 ABI 377，测序方法为末端终止法。取 PCR 产物 16 L，内切
11、酶 1 U，无菌去离子水补充至 20 L，37 过夜消化，终产物经 20 g/L 的琼脂糖电泳分析确定基因型。 1.2.3 血脂和脂蛋白的测定采用酶法测定三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)，高密度脂蛋白(HDL-C)的含量，采用免疫比浊法测定低密度脂蛋白(LDL-C)的含量，在 OLYMPUS 全自动生化仪上完成上述检测。 2 结果 2.1 两组血脂水平比较 冠心病组 TC、TG 和 LDL-C 水平均明显高于对照组，差异有5显著意义(t=2.2111.62,P 均0.05) 。见表 1。 2.2 两组 ApoA5 基因型分布比较 两组检测对象 ApoA5 基因型和等位基因频率分布符合Hard
12、y-Weinberg 平衡规律，具有群体代表性。两组人群中ApoA5 SNP3 位点基因型均以 TC 型多见，其次为 TT 型，而后为CC 型;ApoA5 SNP4 位点基因型均以 TC 型多见，其次为 CC 型，而后为 TT 型。两组 SNP3 位点 TC 基因型比较差异有显著性(2=4.08，P0.05)。见表 2。 2.3 两组各基因型间血脂水平比较 冠心病组 ApoA5 SNP3 位点的 TT 和 CC 基因型病人的 TG水平较 TC 基因型病人显著降低(F=7.56，q=4.69、4.32，P0.05);冠心病组 ApoA5 SNP4 位点的 CC 和 TT 基因型病人的 TG、TC
13、 水平较 TC 基因型病人显著降低(F=9.49，q=3.7612.92 ，P0.05)。见表 3。 2.4 单倍体型和连锁不平衡分析 ApoA5 最常见的单倍体型用 7 个 SNP 变异确定，本研究以ApoA5 SNP3 和 S19W(C56CG)位点大致确定单倍体型，计算单倍体型频率和连锁不平衡系数(D)。 结果显示，冠心病组 ApoA5 SNP3-ApoC3-482C/T 基因间的连锁不平衡与对照组相比较，有一定差异。冠心病组 ApoA5 SNP3-ApoC3-482C/T 单倍体型明显高6于对照组(2=3.42，P0.05) 。见表 4。表 1 两组血脂水平比较表 2 两组 ApoA5
14、 SNP3 和 SNP4 基因型比较表 3 冠心病组 SNP3和 SNP4 各基因型血脂水平的比较表 4 两组 ApoA5-ApoC3 基因间连锁不平衡系数 3 讨论 本研究结果显示，两组人群中 ApoA5 SNP3 位点基因型均以 TC 型多见，其次为 TT 型，而后为 CC 型;两组 SNP3 位点 TC 基因型比较差异有显著性(P0.05)。表明 ApoA5 SNP3 可作为独立的冠心病易感基因，而 SNP4 位点是否为冠心病的遗传标记不能确定。 研究显示，绝大多数种族人群的 ApoA5 SNP3 位点多态性影响其血浆 TG 水平，而血浆 TG 水平是引起冠心病的独立危险因子，因而可以推
15、测基因多态性可能是通过影响血浆 TG 和 LDL-C 水平而间接影响冠心病的发生。PENACCHIO 等4在对高加索人群ApoA5 区域 SNP 位点检测之后认为，SNP1、SNP2 和 SNP3 构成常见的单倍体 ApoA5*1，且与 TG 水平相关，而 SNP4 与 TG 无关;MARTIN 等5 对 SNP4 位点分析认为，在白种人青年男性中 SNP4不伴父辈心肌梗死遗传，对 TG 也无显著影响，但 TC 基因型与 TC和 LDL-C 水平密切相关; 我国毕楠等6也得出了 SNP3 可能与冠心7病的发生密切相关的结论，而且 SNP3 基因型显著影响 TG 的水平，而这些作用在 ApoC3-482CT 位点的分析上则没有表现出来。这些研究均属于关联分析，对于发现疾病易患基因有较强的敏感性，其结果不一的可能原因是由于种族不同、样本量差异等因素的影响。此外遗传现象比较复杂，除了基因突变外，染色体减数分裂和同源染色体重组，以及其他机制如线粒体遗传、父母基因活性不同、甲基化等现象，使预期的 Mendal 遗传模式被扰乱。 本文的研究结果显示，冠心病组 ApoA5 SNP3-ApoC
