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1、1西安和郑州地区丙型肝炎患者的 HCV 基因分型作者：霍艳英徐德忠赵小宁李如琳刘蓬勃王全楚王歆 【关键词】C 型肝炎样病毒属 关键词 :C 型肝炎样病毒属;基因型;多态性，限制性片段长度 摘要 :目的了解西安和郑州地区丙型肝炎病毒（HCV）感染的基因型，比较两地基因型分布的差异.方法采用限制性长度多态性分析（RFLP）法对采自西安地区的 46 份和郑州地区的 40 份 HCVRNA阳性标本进行 HCV 基因型分型研究 .结果西安地区 46 份标本中，25 份（54.3%）为 1b 型病毒，17 份（37.0%）为 2a 型病毒，4份（8.7%）为 1b/2a 混合型病毒;郑州地区 40 份标本
2、中，19 份（47.5%）为 1b 型，13 份（32.5%）为 2a 型，3 份（7.5%）为1a 型， 4 份（ 10.0%）为 1b/2a 混合型病毒，1 份（2.5%）为1a/1b 混合型病毒. 结论两地的优势株均为 HCV1b 型，其次为 2a型，郑州地区有 1a 型菌株的发现. Keywords:hepatitisC-likeviruses;genotype;polymor-phism，restrictionfragmentlength Abstract:AIMToinvestigatethegenotypesofHCVintheHCVinfect2edsamplesinXiana
3、ndZhengzhou.METHODSGenotypesofHCVweredeterminedbyrestrictionfragmentlengthpolymorphism（RFLP）analysisofthe5untranslatedregions（UTR）ofdifferentHCVs.Forty-sixHCVRNAposi-tivesamplesfromXianandfortyfromZhengzhouwerestudied.RESULTSAmongtheforty-sixsamplesfromXian:25/46（54.3%）werefoundtobeof1bgenotype，17/4
4、6（37.0）were2agenotypeand4/46（8.7% ）weremixed-genotypewith1band2a.AmongthosefromZhengzhou:19/40（47.5%）were1b，13/40（32.5%）were2a，3/40（7.5% ）were1a，4/40（10%）weremixed-genotypewith1band2a，1/40 （2.5% ）weremixed-genotypewith1aand1b.CONCLUSIONInbothXianandZhengzhou，thepre-dominantisolatesaregenotype1b，foll
5、owedby2a.Casesofgenotype1awerefoundinZhengzhou. 0 引言 近年发现丙型肝炎病毒（HCV）有 6 个基因型及 50 多个亚3型1. 在不同地区不同人群中 HCV 基因型分布有一定差异2.为了解西安和郑州地区丙型肝炎患者的 HCV 基因型分布，我们对两地共 86 份 HCVRNA 阳性标本进行 RFLP 基因分型研究. 1 材料和方法 1.1 材料 1997/1999 年间收集西安市中心医院、唐都医院传染科以及郑州解放军 153 医院住院及门诊确诊的丙型肝炎患者血清，经 5非编码区（5UTR）通用引物 RT-PCR 确认，西安 46 份和郑州 40
6、份肝炎患者血清 HCVRNA 阳性，取这种血清再分型.M-MLV 购自 GIBCO 公司，Rasin，TaqDNA 聚合酶购自华美，随机引物购自 PROMEGA，脱氧核苷三磷酸（dNTPs） ，HCVPCR 扩增引物由上海 SANGON 提供，DNA 快速纯化回收试剂盒购自博大科技，BSH1236为 MBI 产品，Hae，Hinf购自PROMEGA，ScrF购自 SIGMA. 1.2 方法 1.2.1RNA 提取和 cDNA 合成 50L 血清内加入 50L 消化液（4molL-1 异硫氰酸胍，25molL-1 柠檬酸三钠，pH7.0，0.1molL-12- 巯基乙醇和 5gL-1十二烷基肌氨
7、酸钠）裂解，等体积水饱和酚，氯仿异戊醇抽提两次后，乙醇沉淀，沉淀物溶于 11L1gL-1DEPC 水，于470水溶变性 10min，加入 4L5M-MLVbuffer，1L10molL-1dNTP，2L0.1molL-1DTT，0.6L 随机引物，16URNasin，200UM-MLV，总反应体积为 20L，37 水浴 1h，合成 cDNA. 1.2.2HCVcDNA 的套式 PCR 扩增两对引物 H1/H2，H3/H4选自 HCV5NCR 区基因，将反转录产物进行 5NCR 套式 PCR扩增后得到一条 252bp 的扩增片段. 1.2.3 限制性长度多态性分析（RFLP）第 2 轮 PCR
8、产物纯化回收，溶于 50LTE（pH8.0） ，取其 8L 加入 1L10酶反应buffer，10U 的如下内切酶:（a）Hae（ b）HinfI （c）Bsh1236I或（d）ScrFI，37保温 4h，消化产物 40gL-1 琼脂糖胶电泳，EB 染色后，紫外灯下观察橙红色荧光带 . 1.2.45NCR 区限制性酶切图谱的预测见 Fig1. 图 15NCR 区限制性酶切图谱的预测略 2 结果 52.1 限制性酶切产物电泳图谱见 Fig2. 图 25NCR 区 RT-PCR 扩增产物限制性酶切电泳图谱略2.2RFLP 基因分型结果 2.2.1 西安地区 HCV 基因型 46 例 HCVRNA
9、阳性血清标本中，25 例（54.3%）为 1b 型，17 例（37.0%）为 2a 型，4 例（8.7%）为 1b/2a 混合感染 .2.2.2 郑州地区 HCV 基因型 40 例HCVRNA 阳性血清标本中，1a 型 3 例（7.5%） ，1b 型 19 例（47.5%） ，2a 型 13 例（32.5%） ，1b/2a 混合感染 4 例（10.0%） ，1a/1b 混合感染 1 例（2.5%）. 3 讨论 HCV 基因组具有很高的变异性.根据 HCV 全基因序列或经PCR 扩增后的基因序列片段的同源性，HCV 可分为 6 型 50 多个亚型1 ，型间的变异程度可达 33%3 .越来越多的资
10、料表明，不同型 HCV 的病毒血症、病情严重程度和对干扰素治疗的反应均各不相同，说明 HCV 基因的变异可能与丙肝的慢性化及 HCV 相关的肝细胞癌的发生密切相关.目前对世界各地获得的 HCV 病毒株的基因型别分析表明，不同型 HCV 有一定的地区分布4.如欧美国家HCV1-3 型常见，其中 1a 型占绝大多数;远东包括中国、日本的大6部分地区，1b，2a，2b 型常见，1b 型为主要的优势株;3 型主要分布在印度、巴基斯坦、泰国和新加坡等国家;4a 型主要分布在中东、埃及和中非地区;5a 型以南非地区为主;6a 型则仅在越南、马来西亚等东南亚国家及中国的香港、澳门发现. 我们报道了西安和郑州
11、地区的 HCV 基因型分布，发现两地患者中 HCV 型分布基本相似，均以 1b 型为主，其次为 2a 型，并有一定的混合感染.同北京5 、乌鲁木齐6 、广州7 、贵州8 、泰安9等地报道结果相比，西安与郑州地区 2a 型所占比例偏高，分别为 36.96%和 32.50%.Wang 等10调查了中国大陆 7 个城市，认为我国南方城市主要流行 1b 型，如南京、南宁、成都等地区 90%以上为 1b 型，而北方城市以 2a 型为主，如哈密、沈阳、兰州等地 2a 型占 46%70%.我们的研究结果同此相符，因西安和郑州介于 Wang 等 10调查的南北方城市之间.这对两地丙肝患者的治疗、预后判断及疫苗
12、研制有一定指导意义，并使国内 HCV 基因型分布资料进一步完善.本研究的不足之处在于:样本例数较小，研究对象以慢性肝病患者为主，不象无症状 HCV 阳性献血员更能反映HCV 基因型在人群中的分布，因此，有必要扩大样本量，选择人群资料进一步研究.值得注意的是，我们本次研究还发现了郑州地区有1a 型的存在，这在国内报道中很少见，说明除 1b 和 2a 型外，尚有一定比例其他型别的存在，有待于进一步验证. 参考文献: 71PurcellR.TheHepatitisCVirus:OverviewJ.Hepatology，1997;26（Suppl）:11s-14s. 2TakadaN， TakaseS
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14、mondsP ，ElliottRM.ThecompletecodingsequenceofhepatitisCvirusgenotype5a，thepredominentgenotypeinSouthAfricaJ.BiochemBiophysResCommunicat，1997;236（1）:44-49. 5TangXM，SongHB ， LiWS，XieCF.InvestigationontheHCVinfectionratesandtheHCVgenotypesfromtheserumofthedif-ferentpeopleinBeijingJ .Shiyongyufangyixue（
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