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1、1血液肿瘤树突状细胞的研究关键词：树突状细胞血液肿瘤抗原呈递免疫反应 摘要树突状细胞（DendriticCells ，DC）是目前体内功能最强的专职抗原呈递细胞，具有启动 T 细胞介导的免疫反应的功能。本文介绍 DC 在血液肿瘤中诱导的自身肿瘤杀伤活性、移植免疫、治疗及预后等方面的研究。 树突状细胞（DendriticCells,DC）是近年来倍受人们关注的专职抗原呈递细胞（AntigenpresentingCells,APC） ，能摄取、加工及呈递抗原，启动 T 细胞介导的免疫反应。DC 于 1973 年首次由Steinman 和 Cohn 发现。近年来关于 DC 分化、发育及抗肿瘤应用尤其
2、受到人们的关注。本文对血液肿瘤 DC 的研究作一综述。 1DC 诱导的自身肿瘤杀伤活性 Choudhury 等 1报道，慢性髓系白血病（CML）慢性期患者外周血单个核细胞与细胞因子-粒单核细胞集落刺激因子（CM-CSF） 、白介素 4（IL-4） 、肿瘤坏死因子 （TNF-）在体外共同孵育后，产生了形态学、免疫表型具有 DC 特征的细胞，荧光原位杂交（FISH）表明这些细胞中 t（9 ；22 ）的存在，说明它们来自白血病细胞。特异的体外测定 DC 的功能证实这些细胞具有潜在刺激淋巴细胞增殖的作用。体外产生的白血病 DC 刺激自体 T 细胞产生了强烈的抗白血病细胞的细胞毒活性，但对主要组织相容性
3、复合物2（MajorhistocompatibilityComplex,MHC）匹配的正常异体骨髓细胞表现为低反应。用 DC 刺激的自体 T 细胞抗 CML 靶细胞的细胞毒活性，是体外单用 IL-2 培养扩增的自体 T 细胞作用的 46 倍。DC 刺激的 T 细胞也抑制 CML 克隆前体的生长。这些结果表明，体外细胞因子诱导 CML 细胞向 DC 分化，这些 DC 具有明显的 T 细胞刺激功能。体外产生的 DC 通过对白血病特异性抗原的有效传递产生抗白血病作用。Robinson 等2 报道，急性白血病（AL）细胞在上述细胞因子的作用下亦能向 DC 分化。作者用 21 例 AL 患者的外周血单个
4、核细胞与 GM-CSF、TNF- 共同孵育，15 例细胞成活，其中 12 例可观察到符合 DC 典型的形态学特征。流式细胞分析显示，这些细胞有 DC 特异性抗原 CD1a、CD83 的表达，成熟 DC 还有HLA-DR、CD40 、CD80、CD86 的表达。 9/12 例中混合淋巴细胞反应（MLR）测定，这些培养的细胞具有很强的抗原呈递功能，经FISH 分析证实，一些 AML 的 DC 起源于 5q-及 ph+白血病细胞，另外 2 例髓系和淋巴系双表型白血病 CD19 持续异常表达。AML 恶性转变发生在多能干细胞水平，但是体内随后白血病细胞的分化被局限于某一细胞系、然而体外白血病克隆 50
5、%可自然向单核细胞、粒细胞成熟，另外在细胞因子的作用下可进一步终末细胞分化。该研究证实了 AL 原始细胞衍生的 DC 是恶性起源的，表明一种恶性细胞向具有潜在抗原呈递能力的细胞转变，这类细胞具有很强的呈递肿瘤相关抗原的能力，因此可以用于诱导抗白血病免疫反应。需指出的是，DC 的白血病起源由以下证据支持：在培养的外周血单3个核细胞中白血病原始细胞占 90%98%，细胞数量在整个培养阶段维持稳定且具有恒定的高存活力；在 GM-CSF、TNF- 中培养后观察到的 DC 占 73%92%，比在相同条件下正常祖细胞衍生的DC 比例高；AL 单个核细胞生成的 DC 与正常 DC 前体行为不一致。体外来自
6、12/15 例 AL 所产生的潜在抗原呈递 DC，这一发现提出的两大重要问题有待于进一步研究：一种早期干细胞表型是这种现象的先决条件吗？AL 与其它白血病的进一步研究，需要确定是否如此，以及该现象的真正频率和生物学重要性；这种体外成熟能允许假定的白血病相关抗原更有效地呈递到有适当受体的细胞毒 T 细胞吗？ Choudhury 等 3报道，AML 包括一组血及骨髓中原始髓细胞克隆积累的疾病，恶性细胞表现为髓细胞分化的变异程度及与许多特征性的细胞遗传异常和基因重排有关，特殊的细胞遗传变化通常与特殊疾病表型和临床后果有关。正常多能造血干细胞与白血病克隆共存于骨髓。成功的抗白血病治疗后，骨髓正常造血干
7、细胞的造血功能得以恢复，但大多数病例，缓解仅为暂时的。因此，对于大多数 AML 病人的治疗上的挑战就在于防止复发，以期达到长期缓解。为此，Choudhury 等3 开展了体外诱导 AML 细胞分化成DC 的工作，并以此来刺激自体的抗白血病的 T 细胞反应。他们在体外用 GM-CSF+IL-4 联合 TNF- 或 CD40 配体（CD40L）产生DC，对象 19 例不同染色体异常的 AML 病人，除 1 例外均产生了DC 的形态学表型特征及 T 细胞刺激特性，这些细胞高表达 MHC-4类、类抗原及共刺激分子 CD86 和 ICAM-1。有 3 例通过 FISH分析染色体异常。自体淋巴细胞与 AM
8、L 衍生的 DC 共同培养能溶解自体白血病细胞，并注意到少许抗自体的正常细胞的细胞毒活性，这些正常细胞来自于病人缓解期。结果显示有 DC 表型、功能的细胞能从多数人 AML 标本中获得。如果已知 AML 的生物学异质性，就不会奇怪实验结果的变异及偶尔有 AML 细胞标本未显示有向 DC分化。进一步研究这些细胞确保可决定靶抗原而进行被观察到的免疫活性。这些工作潜在治疗上的应用是重要的，白血病 DC 可潜在地被用作体内细胞的白血病疫苗或体外产生抗白血病的 T 细胞而用于免疫治疗。它们在免疫治疗上的应用于这种通常致死性疾病可消除微小残余疾病及将暂时的反应转变成持久缓解。 据 Cao 等4报道，GM-
9、CSF 可诱导鼠红白血病细胞（FBL-3）分化成类单核细胞的细胞来刺激宿主对白血病的免疫反应，即经GM-CSF 处理后的 FBL-3 细胞，DC 的特异性标志 33D1 及 NLDC-145 的表达阳性率显著升高，同时 MHC- 类分子，CD80、CD86的表达及血管细胞粘附分子 1（VCAM-1）表达显著上调，通过电镜观察到 DC 典型的形态学。功能上， GM-CSF 诱导的 FBL-3 细胞可明显刺激初始异基因的和自体的 T 细胞的增殖，并诱导特异的细胞毒 T 细胞的产生。总之，这些结果对白血病的免疫治疗有重要启示。 2DC 在移植免疫中的作用 Fujii 等5提出，CD34+脐血细胞衍生
10、的 DC 是可诱导抗肿5瘤的细胞毒细胞，如细胞毒 T 细胞、NK 细胞和单核细胞。用射线照射的 MHC-类抗原阳性的 K562 细胞脉冲刺激的 DC 刺激脐血T 细胞能选择诱发清除 K562mHC-类抗原，CD8+ 或 MHC- 抗原 T 细胞的这种杀伤活性几乎完全被抗体消除，而 CD4+T 细胞则不同。这表明 CD34+脐血细胞衍生的肿瘤细胞脉冲的 DC 能诱导抗相应的肿瘤细胞的肿瘤特异性细胞毒 T 细胞，这些细胞毒 T 细胞是经 MHC-类分子识别肿瘤细胞的 CD8+T 细胞。这个发现具有潜在的重要性，提示 DC 在脐血移植中及在临床免疫治疗的应用。 近来，脐血干细胞移植已被用于治疗致死的
11、先天性或恶性疾病，且取得显著成功6，7。积累的实验及临床依据业已证明该临床措施的有效性。脐血移植无需严格的 HLA 相合，GVHD 发生机会少，这可能归因于新生免疫系统的独特性，更能耐受异已抗原。许多研究提示体外各种不同的功能测定中脐血与成人血比较而言缺乏 T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、单核细胞及 DC。Harris 等8，9 与其他学者10，11报道脐血 T 淋巴细胞表型及功能如此不成熟以至于异基因刺激后很少产生细胞毒 T 细胞活性。大量证据表明：造血干、祖细胞起源的 DC 可专门呈递抗原到初始 T 细胞，因此很有可能DC 呈递抗原是脐血初始 T 细胞激活所必需。对于肿瘤治疗，研究者致力于将肿
12、瘤抗原脉冲的 DC 用作治疗性的疫苗，同时也用于体外采用 T 细胞治疗中启动肿瘤抗原特异的 T 细胞12，13。据近来报道，肿瘤抗原负载的 DC 的免疫作用代表了诱导抗肿瘤免疫的有力措施14，15。本研究中，试图用 CD34+脐血细胞衍生的 DC，6诱导抗肿瘤细胞毒性活性作为脐血移植后 GVL 效应的体外模型。 在不久的将来，脐血移植可能成为各种不同的致死性恶性肿瘤尤其血液肿瘤的标准治疗手段，因为它优于其它干细胞来源的移植。但在脐血移植中，GVL 效应减少将成为一个问题。移植免疫治疗的一个目标是创造一种方法，即可避免 GVHD、根除残余肿瘤免疫的策略，也可激活脐血单个核细胞抗未知抗原承载的肿瘤
13、细胞。总之，在造血干细胞移植中，正确使用 DC 可能有益于更特异和更有效的免疫治疗。 外周血干细胞移植时，移植物 DC 可以直接激活宿主残存的T 细胞，导致移植物排斥和移植失败。因此，去除移植细胞中 DC，保留干细胞（CD34+HLA-DR-）的重建活性，将会提高移植的成功率16。同种异基因骨髓移植供者来源 DC 间接呈递受者次要组织抗原，是 GVHD 发生的主要途径17。此外，动物实验表明，骨髓去除性治疗只是去除了大部分，而不是全部的受者 DC。 临床移植中控制 DC 策略18 ：DC 是刺激 T 细胞免疫反应的专职 APC，调控 DC 或干扰 DC 致敏途径，有可能延长移植存活并促进耐受。
14、控制 DC 的可能策略包括： 去除 DC 即移植前预处理移植物达到减少或消除移植物内 DC 的目的，避免直接致敏从而延长移植物存活；抑制 DC 移行或成熟，通过进一步研究 DC 移行机制，选择调节 DC 移行和成熟的某种因子，有可能阻断致敏途径；阻断 DC 与 T 淋巴细胞共刺激信号，如用 CTLA-4-Ig 阻断B7/BB1 和 CD28 间作用有可能诱导耐受；DC 耐受作用，耐受与7嵌合现象的发现，使人们重新认识 DC 在移植中作用，随着对 DC研究的深入，人们有希望筛选出某一类型 DC，用于诱导移植嵌合体形成。 3DC 治疗肿瘤 DC 的研究近年来已成为肿瘤治疗研究的热点，其分化发育及抗
15、肿瘤应用尤其受到人们关注。动物实验表明应用多种形式的肿瘤抗原体外冲击致敏 DC，少量回输即可诱导机体产生极强的抗肿瘤免疫19 。DC 的临床试用亦有报道，DC 回输疗法已试用于非霍奇金 B 细胞淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌、多发性骨髓瘤（MM）晚期患者的治疗。对于非霍奇金 B 细胞淋巴瘤的治疗，是应用抗独特型抗体体外致敏的自体 DC，目前已取得良好的临床疗效15。德国学者20 应用独特型蛋白多肽体外致敏的自体 DC 回输治疗了 7例 MM 患者。其作法是从 MM 患者血清中分离出独特型蛋白，酶消化降解后用 HPLC 纯化出多肽，然后用此多肽体外致敏 CD34+细胞来源的自体 DC，将此类 DC
16、给 MM 患者皮下注射，并随后每隔2 周皮下注射一次独特型蛋白多肽，连续 3 次，结果发现在受检查的 4 例 MM 患者中，有 2 例血中抗独特型 IgM 和 IgG 抗体的水平分别升高约 8 倍和 12 倍，而且还观察到独特型蛋白的特异性 T 细胞免疫反应，表明该疗法的有效性和临床应用前景。 近来有关 DC 用于白血病治疗研究的报道较多，鉴于未成熟DC 具有一定的吞噬能力， Fujii 等21报道，为了用 DC 在体外诱导出自体细胞毒 T 细胞然后用于白血病的免疫治疗，将 G-CSF 动员的8外周血 CD34+细胞用 GM-CSF 和 TNF- 体外培养出 DC，这种DC 混合群体（包括典型的成熟 DC 及未成熟 DC）能摄取外源性蛋白抗原 钥孔戚血蓝素（KeyholdlimpetHemocyanin,KLH）并将之提呈给 CD4+和 CD8+T 细胞，诱导出 KLH 特异性细胞毒 T
