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1、1表皮生长因子对体外长期孵育保存的人胎胰岛的支持作用【关键词】 尿抑胃素 【Abstract】 AIM: To investigate the effects of epidermal growth factor (EGF) on the proliferation and secretion of human embryonic pancreatic islets in vitro. METHODS: Islets were isolated from pancreases of twelve human embryos and cultured in RPMI 1640 medium co
2、ntaining EGF (study group) or without EGF (control group). The percentage of islet beta cells was detected. The insulin content in the media, islet cells and islet beta cells insulin release were measured. RESULTS: By the end of culture, the percentage of islet beta cells was significantly higher in
3、 study group compared with that in control group. The insulin content of media and islet cells release was significantly higher in study group compared with that in control group. CONCLUSION: Results indicated that the addition of EGF to the media prolongs the survival time of islet cells and promot
4、e the proliferation and secretion of islet cells. 【Keywords】 islets of langerhans;preservation, biological;epidermal growth factorurogastrone 2【摘 要】 目的： 研究表皮生长因子（EGF）对促进人胎胰岛增殖与分泌功能.方法: 12 个人胎胰岛分别在含有 EGF（实验组）和不含有 EGF（对照组）的培养基中孵育，观察胰岛 B 细胞的分布，测定培养基中和细胞内胰岛素浓度和胰岛素释放量.结果: 培养结束后实验组胰岛 B 细胞明显高于对照组；培养基和胰岛 B
5、细胞中胰岛素释放量实验组高于对照组.结论: 培养液中加入 EGF 能延长胰岛细胞存活期、促进胰岛细胞增殖和分泌功能. 【关键词】胰岛；保存，生物学；表皮生长因子尿抑胃素 0 引言 为了有足够数量的健康胰岛供给临床移植使用，国内外都在积极研究长期保存胰岛的方法1,2 . 经典的深低温保存方法，需要较贵重的设备，操作繁杂，复苏后胰岛的失活率30%；孵育保存的方法胰岛难以长期存活，但只能维持 1 mo，最多达 5 mo3 ，胰岛细胞的调亡在所难免.我们研究了表皮生长因子（epidermal growth factor）具有促进人胎胰岛的增殖分泌作用.通过观察胰岛细胞的形态，测定细胞内胰岛素和胰岛释放
6、量，以及胰岛组织的存活期，探讨更有意义的保存胰岛的方法. 1 材料和方法 1.1 材料 EGF 购自美国 Sigma 公司， RPMI1640 培养液、人血清购自北京帮定医药公司.百级净化实验室内，所有操作在洁净工作台进行. 1.2 方法 31.2.1 人胎胰岛的获取 平均胎龄 21 周的人胎胰 12 例. 经4无菌 Hanks 液漂洗，去除胰腺包膜、血管、胰管，剪为 1 mm大小的碎块，再次漂洗后置于培养瓶内. 1.2.2 孵育条件 RPMI1640 培养液中加入 80 mLL-1 同型人血清、丁胺卡那霉素 100 umL-1；培养箱中 37, 50 mLL-1 CO2 培养；隔日更换 1/
7、3培养液，共孵育 14 d. 1.2.3 分组 12 个人胎胰岛随机分为实验组和对照组.实验组：表皮生长因子（EGF） ，100 ngmL-1 约 1 mL 加入上述孵育胰岛 14 d 的培养瓶内，共 6 瓶. 每次更换培养液时均按此浓度加入 EGF.对照组:未加 EGF 培养瓶做为对照组,共 6 瓶. 更换培养液时也不加 EGF. 1.2.4 观察指标 免疫组织化学的病理学观察：不同孵育时限分别收集胰岛细胞，100 mLL-1 甲醛固定，石醋切片，HE 染色及胰岛素和高糖素抗体酶标染色，观察细胞有丝分裂相及胰岛 B 细胞分布情况. 不同孵育时限时胰岛功能指标的观察：培养液中胰岛素分泌量；胰岛
8、素释放试验（低糖和高糖加茶碱刺激）. 统计学处理：实验数据用 xs 表示，采用方差分析进行组间均数比较. 2 结果 2.1 酶标组织化学染色的组织学结果 光学显微镜下随机计数4100 个胰岛的观察均值,每个胰岛中随机计数 10 个胰岛细胞中的组织学改变:有丝分裂细胞的比率、胰岛素和胰高血糖素分泌颗粒的数目等. 孵育 30 d 以内，组间未观察到明显差异（P005） ；3 mo 时，对照组胰岛细胞内已无胰岛素和胰高血糖素的分泌颗粒，细胞核固缩或崩解；而 ECF 组的分泌颗粒至 6 mo 时仍不减少，9 mo 时减少 13.6%，细胞形态观察无明显变化.不同孵育时限的胰岛中有丝分裂细胞情况见 Ta
9、b 1. 表 1 不同孵育时限对胰岛中有丝分裂细胞比率的影响（略） Tab 1 Effect of islets beta cells rate in different cultured time (略) 2.2 不同孵育时限的胰岛功能指标观察结果 见 Tab 2.胰岛素释放试验（低糖和高糖加茶碱刺激） ，与培养液中胰岛素分泌量的变化同步，对照组 3mo 以后对释放试验无反应,而 ECF 组反应敏感，并保持到 9 mo 以后. 表 2 不同孵育时限时培养液中胰岛素分泌量的改变（略） Tab 2 Change of serection in insulin culture media in d
10、ifferent culture time （略）3 讨论 近年来，胰岛移植的研究集中在移植部位、移植途径、抗排异反应、和胰岛的保存等方面4,5 . 胰岛移植的临床应用中每一受体均需要足够量的成熟健康的胰岛6-8 ，而一般胰岛孵育保存的最佳时期在 1 mo3 . 在此期间内，培养液中胰腺小块组织的外分泌组织和结缔组织细胞逐步退化减少，而胰岛组织能增殖和成熟51，9. 但孵育 1 mo 后胰岛细胞开始凋亡，其分泌功能下降.1 mo 的短时期内常不能积攒足够的胰岛，所以心须设法延长胰岛的孵育保存时间. 表皮样生长因子（EGF）的 Mr 为 6000 左右，热稳定，是含有 5 个氨基酸残基的多肽，存
11、在于人和动物的尿液、乳汁和血浆中，对多种细胞是很强的促细胞分裂因子，能促进上皮细胞增殖、成熟、并保持活力10-12 . 但尚无 EGF 作用于胰岛保存的报道.在本实验中，胰岛形态学检查提示，含 EGF 培养液的孵育能刺激长期保存的胰岛正常分泌胰岛素和胰高血糖素；胰岛细胞中有丝分裂相的变化提示 ECF 对长期保存的胰岛细胞的增殖有显著的促进作用.培养液中胰岛素含量检测和胰岛素释放试验结果同样提示了上述结论. 在 EGF 作用下，孵育 9 mo 的胰岛仍保持较好对高糖、茶碱刺激的敏锐反应性.在胰岛细胞培养液中加入,可延长胰岛细胞存活期至 10 mo 以上，并促进细胞增殖，使胰岛细胞分泌旺盛.本研究
12、为临床移植提供足量的健康胰岛奠定可靠基础. 【参考文献】 1 Schmied BM, Ulrich A, Matsuzaki H, Ding X, Ricordi C, Weide L, Moyer MP, Batra SK, Adrian TE, Pour PM. Transdifferentiation of human islet cells in a longterm cultureJ. Pancreas, 2001;23(2):157-171. 2 Zheng X,Yao D, Huang KX,Nie MX ,Zheng EJ. Observe pancreatic islet o
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