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1、1血小板因子 4 对环磷酰胺诱导化学损伤小鼠骨髓细胞的保护作用作者：宋俊玲杨岚田琼袁诚君 【关键词】 血小板因子 关键词: 血小板因子;环磷酰胺; 造血干细胞 摘 要:目的 探讨血小板因子 4（PF4 ）对环磷酰胺（CTX ）诱导化学损伤小鼠骨髓的保护作用及机制. 方法 环磷酰胺200mgkg-1 ，腹腔一次性注射，造成药物损伤模型.给CTX 前给予 PF4 预处理，给药后动态观察小鼠外周血白细胞数的变化，并于第 5 和第 8 日，分别用流式细胞仪（ FCM）测定骨髓有核细胞 DNA 的含量及细胞周期变化. 结果 注射 CTX 后 4d，外周血白细胞降至最低点，然后逐渐回升，但 PF4 处理组
2、与单独 CTX 处理组比较无差异（P0.05）. 第 5 日 PF4 处理组的骨髓有核细胞中，G0 /G1 期细胞的百分率较 CTX 组明显提高，细胞的坏死、凋亡率下降（P0.05）.第 8日 PF4 处理组的骨髓有核细胞数较单独 CTX 处理组增加明显（P0.05）.On day5，bone marrow cells in G0 /G1 phase in PF4treatment groups were significantly higher than that in CTX groups，and the necrotic and apop-totic percentage were si
3、gnificantly lower，but there was no difference between the PF4groups and the PBS control groups.On day8after CTX treatment，bone marrow cellu-larity in PF4treatment groups were significantly higher than that in CTX groups.CONCLUSION PF4can protect murine J3bone marrow from the cytotoxic effects of CTX
4、.PF4should be a potent protective agent during chemotherapy. 0 引言 骨髓造血系统是对化疗非常敏感的组织，在造血系统恶性肿瘤的治疗过程中，常因骨髓造血抑制而限制化疗药物的剂量，直接影响肿瘤的治疗效果.环磷酰胺（CTX）是肿瘤化疗中最常用的烷化剂，但其对正常骨髓细胞也有很强的抑制作用.此外，作为免疫抑制剂的化疗药物，CTX 还是干细胞移植前预处理最常用的药物之一.已有研究表明，血小板因子 4（PF4）对 5-FU 处理的小鼠骨髓有明显的保护作用1 .但 Han 等2 体外实验证明，PF4 对 HL-60，HEL ， SMMC7721
5、及 MKN-45 等肿瘤细胞株无保护作用 .PF4的保护作用与其能可逆性抑制造血干/祖细胞的增殖有关 3 ，但对烷化剂 CTX 的作用至今尚未见报道 .为进一步探讨 PF4 对 CTX 诱导的损伤小鼠骨髓造血干细胞的影响，我们建立了 CTX 诱导小鼠骨髓损伤的实验动物模型.通过流式细胞仪测定细胞周期的变化，探讨了 PF4 对造血干细胞的化疗保护作用的机制. 1 材料和方法 1.1 材料 动物:一级 BALB/c 小鼠 36 只，雄性，体质量1820g，鼠龄 1012wk，由第四军医大学实验动物中心提供;药J4物:PF4 购自 Sigma 公司，系 500g 甘氨酸缓冲液冻干品，用 5mL三蒸水
6、稀释成工作液，4 冰箱备用，稀释浓度为100mgL-1 .CTX 由江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号 01111221，200mg/支，溶于 10mL 生理盐水中，稀释浓度为20gL-1 . 1.2 方法 1.2.1 分组 将 36 只小鼠随机分为 3 组，即 PF4 处理组、单独 CTX 处理组和 PBS 对照组，每组 12 只.PF4 处理组:小鼠一次性ip CTX，剂量为 200mgkg-1 ，用 CTX 前 26h 和 20h各 ip PF4，剂量为 40gkg-1 .单独 CTX 处理组:CTX 用法同上，给 CTX 前 ip 等体积的 PBS 缓冲液.PBS 对照组:按上述方法注
7、射等体积的 PBS.各组分别于给 CTX 前及给 CTX 后 2，4 ，5，6和 8d 取尾静脉血进行白细胞计数 . 1.2.2 制备骨髓有核细胞悬液 给予 CTX 后第 5 日及第 8 日每组小鼠各取 6 只，以颈椎脱臼法处死 .取出股骨，剔除肌肉和结缔组织，剪开股骨两头，用 6 号针头以 RPMI1640 液冲出骨髓细胞，再用 4 号针头过滤制成单个骨髓细胞悬液，检测骨髓有核细胞（bone marrow karyocyte，BMK）数. 1.2.3 样品制备 将上述单个骨髓细胞悬液离心J5（1000rmin-1 ，5min） ，弃上清，用 PBS 洗涤 2 次，再加入 1mL PBS 重悬
8、成单细胞悬液，加入 2mL 无水乙醇，立即混匀，用封口膜封口，放置 4 冰箱冷藏备用 .每份样品的细胞数约为（510 ） 105 个. 1.2.4 细胞周期分析 取上述样品，用 PBS 洗 2 次，以洗去残留的无水乙醇，加 100L PBS 后混匀，用碘化丙锭染色后，以流式细胞仪分析细胞周期及 DNA 含量的变化.以上实验均重复 2 次. 统计学处理: 数据用 x s 表示，组间比较采用 t 检验. 2 结果 2.1 PF4 对 CTX 损伤小鼠外周血白细胞的影响 各组小鼠外周血白细胞的动态变化见 Fig1.单独用 CTX 后 4d，WBC 降至最低点，下降约 86.0%，从第 5 日起开始回
9、升，但与 PF4 处理组相比较无显著差异 （P0.05） ，表明 PF4 对 CTX 化学损伤小鼠白细胞数的下降无明显促进其恢复的作用. 图 1 PF4 对 CTX 损伤小鼠白细胞的影响略 2.2 PF4 对 CTX 损伤小鼠骨髓细胞数的影响 单独用 CTX 后5d，骨髓细胞数减少约 28.0%，8d 后有明显上升.PF4 处理组与单J6独 CTX 处理组相比较，注射 CTX 后 5d 骨髓细胞数无明显增加，但第 8 日增加较明显（P0.01，Tab1 ）. 表 1 PF4 对 CTX 损伤小鼠骨髓细胞数的影响略 2.3 PF4 对 CTX 损伤小鼠骨髓细胞周期的影响 流式细胞仪DNA 直方图
10、显示 :第 5 日 PF4 处理组（Fig2A ）经 PF4 预处理后仅有 0.5%发生坏死、凋亡，而单独 CTX 处理组（ Fig2B）细胞的 G0 /G1 峰前出现荧光强度较低的坏死、凋亡峰，约占 12.6%，CTX 组与 PBS 对照组（Fig2C）及 PF4 处理组相比差异均有显著性（P0.01）.细胞周期分布分析显示，PBS 对照组正常骨髓细胞多数处于 G0 /G1 期，S 期次之，G2 /M 期最少，CTX 组的细胞周期发生变化，G0 /G1 期细胞占 75.7%，而 PF4 处理组 G0 /G1 期比例占 82.1%，较单独 CTX 处理组明显增多，差异有显著性（P0.05）.
11、3 讨论 PF4 是激活的血小板 颗粒释放的特异蛋白，属于 CXC 类趋化因子，除与炎症有关外4，5 ，与多种细胞的生物功能均有着密切联系，其中与造血和肿瘤的关系日益受到重视，包括抑制J7血管新生6，7 、抑制内皮细胞增殖8 及以依赖和不依赖肝素两种途径抑制造血干/祖细胞的增殖 9-11 .因此，PF4 又属于造血负调控因子12，13 .已有研究表明， PF4 对早期造血干/祖细胞尤其早期巨核细胞的增殖、分化有抑制作用，其抑制巨核细胞集落形成的作用是可逆的，停用 PF4 后巨核细胞即恢复增殖活性，从而对造血干细胞起到了保护作用1，3 ， 14 .环磷酰胺是肿瘤化疗最常用的烷化剂，通过与 DNA
12、 交叉联结，而直接破坏 DNA，其疗效高低与血药浓度成正比.除对 G0 期（静止期）细胞作用较弱外，对增殖周期中各期细胞均有破坏作用，还可致染色体畸变、突变而影响分裂，引起造血细胞的坏死、凋亡15，16 .本实验显示，200mgkg-1 环磷酰胺可引起骨髓细胞坏死、凋亡，第 5 日比例达 12.6%，与正常对照组相比，差异有显著性 ;经 PF4预处理后其坏死、凋亡率明显下降，而 G0 /G1 期细胞相对增多，与环磷酰胺组相比差异有显著性，表明 PF4 可降低造血干细胞对化疗药物的敏感性，避免环磷酰胺诱导的凋亡、坏死，从而保护造血干细胞.但第 8 日 PF4 处理组与对照组比较 G0 /G 1
13、期比例无明显差异（P0.05） ，进一步证实了 PF4 对造血干细胞的抑制作用是短暂、可逆的. 图 2 PF4 影响 CTX 损伤小鼠 BMK 细胞周期分布的 FCM 分析略 J8关于 PF4 这种保护作用的机制还不十分明确 .本实验证实，PF4 可阻止 G0 /G1 期细胞进入 S 期，从而使 G0 期（静止期）细胞增多，可避免受细胞毒药物的损害.用 PF4 预处理后其骨髓细胞总数增加，尤其是可提高骨髓造血干/祖细胞静止期的数量，这样根据一定的化疗药物杀伤恒定数目的骨髓造血干/祖细胞15 ，故化疗后活存的造血干/祖细胞绝对值增多，有利于造血功能的重建 .Han等2 研究显示，转化生长因子 1（TGF1） 、足叶乙甙单用或与 PF4 联用相比，与 PF4 联用组凋亡细胞明显减少，表明 PF4 可避免细胞毒药物和转化生长因子（TGF1）诱导的凋亡，与本实验相符. 结合文献，其干扰细胞周
