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1、1血小板活化因子对气道平滑肌细胞的增殖及核因子NF作者：宋颖芳，李焕章，苏明权，吴昌归 【关键词】 ,血小板活化因子 【Abstract】 AIM: To investigate the effects of plateletactivating factor (PAF) on the proliferation of rat airway smooth muscle cells （ASMCs） and the expression of nuclear factorB (NFB). METHODS: MTT assay and flow cytometry were used to anal
2、yze the effects of PAF on the proliferation of ASMCs in vitro and NFB activity change of the ASMCs stimulated by PAF was examined by electrophoretic mobility shift assay (EMSA). The effects of Nacetylcysteine (NAC) on the function of PAF were also studied. RESULTS: PAF (110-6-110-9 mol/L) stimulated
3、 the cell proliferation and reached its maximal effect at 110-7 mol/L. The proliferative index (PI) of the ASMCs significantly increased（P0.05）and the NFB activity was enhanced obviously（P0.01 ） following stimulation of PAF (10-7 mol/L). NAC (20 mmol/L) partly inhibited the cell proliferation and th
4、e increased NFB activity induced by PAF （P0.05 ）. 2CONCLUSION: PAF can stimulate the proliferation of ASMCs, which may be achieved partly through the activation of NFB pathway. 【Keywords】 plateletactivating factor；airway; smooth muscle cell；nuclear factorB 【摘要】 目的：观察血小板活化因子(PAF)对离体培养的大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs
5、)的增殖及其核转录因子 NFB 蛋白表达的影响. 方法：MTT 法及流式细胞仪检测细胞周期， EMSA 法检测PAF 刺激后 ASMCs 中 NFB 的活性改变；观察 N 乙酰半胱氨酸（NAC）干预对 PAF 作用的影响. 结果：PAF 在 110-6110-9 mol/L 范围内均能促进 ASMCs 的增殖(P0.01) ，且 110-7 mol/L 时增殖作用最强， ASMCs 细胞增殖指数明显增高（P0.05） ，同时 ASMCs 细胞核内 NFB 活性明显增加（P0.01）. 预先用 20 mmol/L NAC 干预后，PAF 的促增殖作用及核内 NFB 活性均被明显抑制，但该抑制作用
6、呈不完全抑制（P0.05）. 结论：PAF 能促进 ASMCs 的增殖,这一作用部分是通过激活 NFB 通路而发挥的. 【关键词】 血小板活化因子；气道;平滑肌细胞；核因子NFB 0 引言 血小板活化因子(PAF)是一种强效的内源性磷脂类介质, 对气道和肺血管功能起重要的调节作用,参与气道慢性炎症、肺动脉高压、3气道高反应性、急性肺损伤等多种呼吸系统疾病的发生发展过程. 近来研究发现 PAF 是 NFB 激活的最直接、最近端的关键性调节剂1 ，直接参与 NFB 的活化. NFB 在调节 IL6，TNF 等炎性基因的表达及细胞增殖、凋亡中起重要的作用. 但 PAF 对 NFB 的活化是否与其对气
7、道平滑肌细胞(ASMCs)增殖的影响作用有关，尚需探讨. 为此，我们检测了 PAF 对 ASMCs 增殖的影响及 PAF 刺激后ASMCs 的 NFB 活性改变. 1 材料和方法 1.1 材料 MTT，PAF ，NAC（N 乙酰半胱氨酸） 、胰蛋白酶（Sigma公司） ；型胶原酶、DMEM（Gibco 公司） ；胎牛血清（FCS ，杭州四季青生物公司） ；NEPERTM 试剂盒（美国 Pierce 公司） ；Gel Shift Assay 试剂盒（美国 Promega 公司） ；32P ATP（北京亚辉生物医学工程公司） ； SD 大鼠 1 只，雄性，体质量 90 g（第四军医大学实验动物中心
8、）. 流式细胞仪 EPICS XL（Coulter 公司）. 1.2 方法 1.2.1 大鼠 ASMCs 培养及鉴定参照文献 2的消化培养法获得. 培养的 ASMCs 以形态特征及其抗 actin mAb 对 ASMCs 进行免疫组化 SABC 法染色鉴定. 取 510 代细胞（细胞纯度95）用于实验. 1.2.2MTT 法检测不同条件下的 ASMCs 增殖活性取对数生长期 ASMCs 以 7103/孔接种于 96 孔培养板内，各浓度设 8 个复孔，437，50 mL/L CO2 孵箱内孵育 12 h 使细胞贴壁，弃上清液，无血清 DMEM 液同步化 24 h 后，将细胞分为 3 组，即 PA
9、F 组、NAC 组和对照组. PAF 组加入含 PAF 及 5 mL/L FCS 的 DMEM 液，使 PAF 终浓度分别为 110-6，110-7，110-8 和 110-9 mol/L；NAC 组在同步化 2.5 h 时换用含 20 mmol/L NAC 的DMEM 液继续同步化 21.5 h,而后分别加入上述不同浓度的PAF,37，50 mL/L 孵箱培养 48 h，再每孔加入 MTT 液 20 L，继续培养 4 h 后，弃上清，加入二甲基亚砜(DMSO) 150 L 振荡10 min，酶联免疫检测仪测定各孔 A492 nm，并确定 PAF 作用的最佳浓度；对照组仅加入含 5 mL/L
10、FCS 的 DMEM 液. 1.2.3 流式细胞仪检测不同条件下 ASMCs 增殖指数的改变将新传代的 ASMCs 接种于 100 mL 培养瓶内，用上述方法对各组ASMCs 进行同步化处理后，PAF，NAC 组均加入含 110-7 mol/L PAF 及含 5 mL/L FCS 的 DMEM 液，对照组仅加入含 5 mL/L FCS 的 DMEM 液，孵育 36 h 后收获各组细胞，配成细胞密度为 1106/L 的悬液，碘化吡啶染色，4避光放置 30 min，过300 目滤网，用流式细胞仪进行细胞周期分析（各浓度组重复 3 次） ，并计算细胞增殖指数(PI)，PI=(S+G2/M)/(G0/
11、1+S+G2/M)100% 1.2.4ASMCs 中 NFB 活性的检测 1.2.4.1ASMCs 细胞核蛋白的提取将新传代的 ASMCs 接种于 100 mL 培养瓶内，对照组及 PAF 组用含 5 mL/L FCS 的DMEM 液培养，待细胞汇合近瓶底面积的 60时，NAC 组换用含5NAC 20 mmol/L 及 5 mL/L FCS 的 DMEM 液培养 21.5 h，而后将 110-7 mol/L 的 PAF 同时加入 PAF 组及 NAC 组，分别于0.5，1，2 和 4 h 收集细胞（1106）. 使用 NEPERTM 试剂盒提取 AMSC 的核蛋白，分装并于-70 保存. Br
12、anford 法进行核蛋白浓度检测. 1.2.4.2EMSA 法检测 NFB 的活性按 Promega 公司的 Gel Shift Assay Systems 试剂盒提供的说明书进行 . NFB 寡核苷酸探针序列为：5AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC3(P1), 3TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG5（P2） ，采用 T4 寡核苷酸激酶法标记探针，游离探针用乙醇纯化法除去. 而后继续使用该试剂盒进行 DNA 结合反应，每一胶板同时用一道标准品做对照，此标准品为用试剂盒提供的 HeLa 细胞核提取物与 32P 标记的 SP1 探针结合反应而成. 行 50 g/L 非变性聚丙
13、烯酰胺凝胶电泳（ 150 V，20 min）, 干胶 1 h；-70 放射自显影 48 h. 用凝胶图像分析系统(密度扫描仪) 对显影胶片进行扫描，以各样品与标准品电泳滞后带的 A492 nm 值表示 NFB 的活性. 1.2.4.3 特异性及非特异性竞争试验取 110-7 mol/L PAF组 1 h 的核蛋白 2 g，按上述方法，在加入 NFB 标记探针前加入未标记 NFB 探针 1 L (1.75 mol/L)或未标记的无关探针（SP1, 1.75 mol/L） 1 L，室温孵育 15 min，加入标记探针. 电泳，放射自显影. 统计学处理：各组实验数据以 xs 表示，组间比较采用6SP
14、SS 10.0 软件进行. 当方差齐性时，用 oneway ANOVA 检验，同时用 SNKq 检验进行两两间比较；当方差不齐时，采用KruskalWallis H 检验. 2 结果 2.1ASMCs 生物学特性倒置光学显微镜下贴壁的气道平滑肌细胞呈长梭条形，细胞间互相交错排列呈网状、旋涡状或栅栏状，免疫组化染色显示抗 actin mAb 呈阳性染色，主要分布于细胞质 . 2.2MTT 法检测 PAF 对 ASMCs 有明显的促增殖作用（P 0.01，n=8） ，其中 110-7 mol/L 的 PAF 对 ASMCs 的作用最明显，其 A492 nm 是对照组的 2.16 倍（0.1860.
15、002 ） vs (0.0850.002)，n=8，P0.01 ；NAC 组 A492 nm 为(0.1050.002)，介于 PAF 组及对照组之间（Fig 1）. 2.3PAF，NAC 对 ASMCs 细胞周期的影响 110-7 mol/L PAF 处理 ASMCs 36 h 后，ASMCs 的 S 及 G2+M 期细胞百分比均显著高于其他两组（P0.05 ） ，而预先用 NAC 干预后，细胞 PI较 PAF 组明显下降，但仍高于对照组（P0.05，Tab 1）.表1PAF 及 NAC 作用 36 h 对 ASMCs 细胞周期的影响（略） h2.4PAF,NAC 对 ASMCs 的 NFB
16、 活性的影响刺激前 ASMCs 中具有一定的 NFB 活性，在 110-7 mol/L PAF 刺激 4 h 内其活性均有不同程度的增加，且在 1 h 时活性最强；此时的电泳滞后带的相对 A492 nm 值较同期对照组增加近 3 倍（1.630.17） vs 7(0.410.09)，n=3，P0.01 ；加入 NAC 后，NFB 活性介于PAF 组及对照组间，其电泳滞后带的相对 A492 nm 值为（1.150.21）, 结果见 Fig 2. 特异性竞争试验的电泳滞后带变浅，而非特异性竞争试验的电泳滞后带颜色无明显改变（Fig 3）. 3 讨论 慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是多种致病因素（理化性损伤、吸入毒性颗粒、微生物感染
