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1、第三节酶标记物的制备 一 酶制剂及其底物 作为标记抗体用的酶应满足下列要求 1 活性高 2 性质稳定 3 专一性强 4 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 5 方法敏感 重复性好 简单易行 6 酶的底物易于配制保存 酶及底物价廉目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶 HRP 和碱性磷酸酶 AP 其次还有葡萄糖氧化酶 半乳糖苷酶 溶菌酶和苹果酸脱氢酶等 辣根过氧化物酶 HorseradishPeroxidase HRP HRP比活性高 稳定 分子量小 纯酶容易制备 HRP广泛分布于植物界 辣根中含量高 由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白 糖含量18 HRP由多个同功酶组成 分子量为
2、40 000 等电点为PH3 9 酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异 PH5左右 HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm 一般以OD403nm OD275nm的比值RZ表示酶的纯度 高纯度的酶RZ值应在3 0左右 最高可达3 4 HRP酶促反应 酶促反应的过程 HRPDH2 H2O2 D 2H2O供氢体的种类很多 形成的产物特点不一 目前用得较广泛和较满意的供氢体是 OPD和TMB 另外 还有一种供氢体称ABTS 2 2 边氮基 双 3 乙基苯并噻吡咯啉 6磺酸 灵敏度和稳定性均好 由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂 因此酶促反应中使用的H2O2不能过量 HR
3、P常用底物 碱性磷酸酶 alkalinephosphatase ALP ALP 系小牛肠粘膜和大肠杆菌中提炼出来的一种磷酸酯的水解酶 由多个同功酶组成 小牛肠粘膜ALP分子量为100kDa 酶作用的最适pH为9 6 大肠杆菌ALP分子量为80kDa 最适pH为8 0 ALP作用底物较多 常用的酶底物有对硝基苯磷酸盐 PNP 甘油磷酸钠 磷酸萘酯等 ALP主要用作双标记染色 研究递质共存及酶免疫测定 ALP标记抗体 一般采用戊二醛作交联剂一步法 使酶和抗体蛋白的氨基分别与戊二醛的两个醛基结合 ALP常用底物 作为酶标记对象的抗原与抗体要求 抗原要求纯度高 抗原性完整 抗体需要特异性好 效价高 亲
4、合力强以及比活性较高 能批量生产 易纯化 二 酶结合物的制备方法 制备方法要求 1 技术方法简单 产率高 重复性好 2 标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性 3 酶标记物稳定 不形成聚合物 几种常用标记方法比较 一 过碘酸盐氧化法 原理 HRP是一种糖蛋白 糖链部分无活性 其己糖邻位 0H可被碱性过碘酸盐氧化成醛基 再与抗体蛋白中游离 NH2形成schiff碱 酶与抗体结合反应后 再加入硼氢化钠 NaHB4 还原成稳定的HRP IgG偶联物 所获酶标记抗体的产率高 将近70 的HRP和IgG结合 99 的Ig与酶结合 酶与Ig的活性无重大损失 是目前最常用的方法 1 HRP标记腹水单抗 过碘酸钠
5、氧化法 HRP直接标记腹水中的单抗1 5mgHRP溶解于0 5ml0 1MNaHCO3中 2 加0 5ml10mMNaIO4 混匀 盖紧瓶塞 室温避光作用2h 3 加0 75ml0 1MNa2CO3 混匀 4 加0 75ml小鼠腹水单抗 混匀 5 加SephadexG25干粉0 5g 混匀 盖紧 室温作用3h 6 用少许PBS将交联物转移于一支下口具玻璃棉的5ml注射器外筒中 7 用少许PBS将交联物全部洗出 8 收集洗出液 加1 20V新鲜配制的5mg mlNaBH4溶液 混匀 室温作用30min 9 再加3 20VNaBH4溶液 混匀 室温作用1h 10 将交联物过SephdexG200
6、2 6 100cm 层析纯化 分管收集第一峰 Fig2 1 GelfiltrationofthereactionmixtureofHRPconjugatedtomAb13A4onaSephadexG200column 2 6cm 100cm equilibratedwithPBS atarateof0 15ml minandatube 15min 二 戊二醛交联法 原理 戊二醛是一种常用的同型双功能交联剂 通过它的两个醛基分别与HRP和抗体蛋白的氨基结合 形成HRP 戊二醛 Ab蛋白结合物 戊二醛一步法是将酶和待标记抗体混合 同时加入戊二醛进行交联反应 戊二醛二步法是将酶先与戊二醛作用 形成酶
7、 戊二醛结合物 结过透析或层析除去未结合的戊二醛 然后再与抗体结合 HRP标记多抗 1 取10mgHRP溶于0 2mL1 25 戊二醛 用0 01mol L pH6 8PB将25 戊二醛稀释为1 25 室温 20 左右 反应结合18h 2 用0 15mol LNaCl平衡过的SephadexG 50凝胶柱洗脱 除去游离的戊二醛 或用0 01mol L pH7 2PBS 4 透析过夜 3 将5mg抗体IgG溶于1mL0 15mol LNaCl 再与醛化HRP溶液 10mg mL 混合 4 加入0 1mL1mol LpH9 6碳酸盐缓冲液 调节pH至9 0 9 6 4 电磁搅拌下结合24h 5 加
8、入0 1mL0 2mol L赖氨酸 0 29g溶于10mL蒸馏水 4 放置2h 以封闭残留的醛基 终止反应 6 装入透析袋 以0 01mol L pH7 2PBS 4 透析过夜 或通过SephadexG 200凝胶柱层析 用PBS洗脱 收集第1峰洗脱液 本法标记步骤比较简单 重复性好 缺点 酶的利用率低 一般只有2 4 的酶与蛋白质结合 三 标记抗体质量判定 2 定量和克分子比值测定 分光光度计测定 光程1cm 酶量 mg ml OD403nm 0 4IgG量 mg ml OD280nm OD403nm 0 3 0 62 过碘酸盐 IgG量 mg ml OD280nm OD403nm 0 42 0 94 0 62 戊二醛 酶量 mg ml IgG量 mg ml 酶量HRP IgG 摩尔比 440 000160 000IgG量标记率 OD403nm OD280nm 用于ELISA酶标抗体的各项指标参数 直接ELISA法测HRP IgG效价 采用直接ELISA法测定酶标单抗效价 以特异显色为1 0时的稀释倍数作为酶标单抗效价 四 标记抗体保存 加等量甘油后 小量分装 20 存放加等量60 甘油4 保存以BSA或脱脂牛奶作保护剂 冻干保存
