《血管内皮生长因子反义寡核苷酸对白血病细胞系HL60细胞作用的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《血管内皮生长因子反义寡核苷酸对白血病细胞系HL60细胞作用的研究（15页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1血管内皮生长因子反义寡核苷酸对白血病细胞系HL60 细胞作用的研究作者：孙玲，王一浩，刘少君，王芳，马鸿雁，孙慧 席雨人【摘要 】 本研究探讨 VEGF ASODN 抑制白血病细胞内源性VEGF mRNA 的表达作用及其与白血病细胞凋亡的关系。用阳离子聚合物介导硫代修饰 VEGF ODN 转染体外培养白血病细胞系HL60细胞后，采用 MTT 法检测细胞增殖抑制率，RTPCR 检测VEGF mRNA 表达，以细胞形态学，凝胶电泳，流式细胞术观察细胞凋亡。结果显示： 反义组与错义组、空白对照组相比，在细胞增殖抑制率和 VEGF mRNA 的表达水平方面均具有显著性差异(p0.05） 。反义组可见
2、细胞皱缩，颗粒增多，核固缩并出现细胞碎片，而错义组、空白对照组细胞轮廓清楚，胞体透亮，生长旺盛；反义组有凋亡梯形带，错义组和空白对照组仅见 1 条 DNA 条带；反义组细胞凋亡率达 19.46，与错义组、空白对照组相比具有显著性差异（p0.05） 。 VEGF ASODN 联合 VP16 的细胞凋亡率与等同条件单用 VP16 组相比有统计学差异（p0.05） ； 且凋亡率具有时间和剂量依赖关系。结论： VEGF ASODN 能抑制白血病细胞内源2性 VEGF mRNA 的表达，诱导白血病细胞的凋亡，抑制增殖，且增强 VP16 对白血病细胞诱导凋亡作用，两者联合效应具有相加作用。【关键词】 白血
3、病Effect of Vascular Endothelial Growth Factor Antisense Oligonucleotide on Human Leukemic Cell Line HL60Abstract This study was aimed to investigate expression of vascular endothelial growth factor mRNA (VEGF mRNA) and its relationship with leukemic cell apoptosis after VEGF antisense oligonucleotid
4、e(VEGF ASODN )transferred into HL60 cells. The phosphorothiate VEGF ODN was transferred into HL60 cells in vitro by using cation poly mediated method, the inhibitory rate of cell proliferation was assayed by MTT, expression of VEGF mRNA was measured by RTPCR, cell apoptosis was detected by cell morp
5、hology observation, DNA agarose gel electrophoresis and flow cytometer (FCM). The results showed that difference of the inhibitory rate of cell proliferation and the relative expression of VEGF mRNA 3between ASODN group and MSODN or control groups under the same condition（p0.05） was found between MS
6、ODN and control. The number of clusters of cells in ASODN group decreased; the morphology features of apoptotic cells involved cell shrinking,more granulation in cytoplasm, nuclear contracting and many fragments of cells. In MSODN and control groups, however, cells were plump and clear, and grow hea
7、lthly. The result of electrophoresis revealed DNA ladder in ASODN group, while only one band of DNA in control groups.The rate of cell apoptosis was 19.46 in ASODN group with a significant difference as compared with MSODN groups and control（p0.05）.The rate of HL60 cell apoptosis in combination of V
8、EGF ASODN with VP16 was significantly higher than that in VP16 alone （p0.05） and showed time and dose dependence. It is concluded that VEGF ASODN can downregulate expression of VEGF mRNA of HL60 cells, induces the apoptosis , inhibits the proliferation of HL60 cells and enhances VP16induced apoptosi
9、s in HL60 cells, the VEGF ASODN in combination with VP16 shows additive effect.4Key words VEGF；leukemia ；antisense oligonucleotide； HL60 cell; apoptosisJ Exp Hematol 2007; 15(4):849-853血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）是一种多功能的糖基蛋白，在白血病患者体内呈高表达。体外白血病细胞株的培养证实， 白血病细胞不仅分泌 VEGF, 而且表达特异性 V
10、EGF 受体, VEGF 可通过旁分泌参与白血病细胞的增殖及浸润，而且与白血病细胞表面特异性受体结合促进白血病细胞生长及降低对放化疗的敏感性。对其机制目前尚存有争议，有学者认为 VEGF 可直接促进白血病细胞增殖，而有学者认为 VEGF 具有抗凋亡作用。本研究针对上述争议通过反义技术直接封闭内源性VEGF 表达观察白血病细胞生长情况，探讨 VEGF 和白血病细胞的关系。研究对象白血病细胞系 HL60由郑州大学医学院组织胚胎教研室提供。试剂和设备5RPMI 1640 培养液(Gibco 公司产品)，胎牛血清(TBD 公司产品)，TRIzoL Reagent(美国 Invitrogen 公司产品)
11、，梭华SofastTM 基因转染试剂盒(厦门太阳马生物工程有限公司产品)，Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(加拿大 MBI 公司产品)，PCR 试剂盒(上海 Sangon 生物工程技术服务公司产品)，Annexin VFITC 试剂盒(晶美生物工程有限公司产品)，VP16(山东齐鲁制药有限公司产品)，CO2 孵育箱(德国 Heraeus 公司产品)，Eagle eyeTM凝胶扫描分析系统(美国 Stratagene 公司产品)，DNA 热循环扩增仪 PE480(美国 PE 公司产品) ，流式细胞仪 EPILS_XL(美国BeckmanCo
12、ulter公司产品)。硫代磷酸寡脱氧核苷酸（thiophospate oligonucleotide，ODN ）和引物的合成VEGF ODN 按参考文献1 由上海 Sangon 生物工程技术服务公司 391 型 DNA 合成仪(PE 公司)合成。VEGF ASODN:5 T GGCTTGAAGATCTCGAT 3，VEGF MSODN:5 TACGTATGGTGTACGATC 3，VEGF 引物扩增产物 545 bp；VEGF 上游引物:5 T CGGGCCTCCGAAACCATGA 3，VEGF下游引物:5 CCTGGAGAGAGATCTGGTTC 3；actin 内参照扩增产物为 300
13、bp，上游引物：5TCCTGTGGCATC CACGAAACT3，下游引物：5GAAGCATTTGCG 6GTGGACGAT3。细胞培养采用含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 培养液，将 HL60细胞置于 37、5% CO2、饱和湿度的恒温孵育箱中培养2 。VEGF ODN 对 HL60细胞增殖及 VEGF mRNA 表达的影响将 VEGF ASODN、MSODN 各配成 5，10 ，20 mol/L 3 种不同浓度。严格按照梭华SofastTM 基因转染试剂盒说明书具体步骤操作。增殖抑制率的 MTT 法检测按 MTT 法常规操作，检测增殖抑制率，增殖抑制率计算公式如下：增殖抑制率（1
14、实验组值/空白对照组值）100%VEGF mRNA 表达的 RTPCR检测7实验分为 3 组： ASODN 组、MSODN 组、空白对照组。空白对照组加入相同量不含血清的 RPMI 1640 培养液，以 actin为内对照，用 RTPCR方法检测转染后各组 HL60细胞 VEGF mRNA 的表达。采用 6 孔培养板，按照上述步骤将 20 mol/L VEGF ASODN 转染 HL60细胞 48 小时后，参照 TRIzoL 提取试剂盒说明书抽提 RNA,提取的 6 l RNA 样品在含 6%甲醛的 15 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳，在电压 8 V/cm 下电泳 30 分钟后，置于凝胶扫描成像
15、系统下观测结果并照相检测 RNA 的完整性。用分光光度法作单链 RNA 的定量，参照试剂盒说明书 cDNA 制备进行操作，完成 cDNA 合成后进行 PCR 扩增。取 8 l加有载样缓冲液的扩增产物加至含有溴化乙锭的 2琼脂糖凝胶中，在电压 8 V/cm 下电泳 60 分钟后，置凝胶扫描成像系统下观察结果并照相。将各样本的 PCR 光密度值除以各内对照 actin的 PCR 光密度值，以其比值作为各目的 mRNA 的表达量。检测重复 3 次。VEGF ODN 对 HL60细胞凋亡的影响VEGF ODN 转染 HL60细胞 48 小时后，于倒置显微镜下观察细胞形态学变化。收获各组细胞，提取 DNA 置琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察并凝胶扫描照相。按 FCM Annexin VFITC 试剂盒说明书操作上机检测细胞凋亡率。8VEGF ODN 与 VP16 联合对 HL60细胞作用实验分组如下：VEGF ASODN+ VP16(5 g/L)组, VP16(5 g/L) 组； VEGF ASODN+ VP16(10 g/L) 组, VP16(10 g/L) 组； VEGF ASODN+ VP16(20 g/L) 组, VP16(20 g/L) 组；空白对照组。取浓度均为 2105/L 细胞
