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1、1血小板第 4 因子对急性放射损伤小鼠骨髓基质细胞的保护作用作者：高瑛，杨岚，田琼，方恒虎，聂蕾，刘水冰，卫张蕊【关键词】 骨髓基质细胞Protective effects of platelet factor 4 on bone marrow stromal cells of acute radiation injury in mice【Abstract】 AIM: To investigate the protective effects of platelet factor 4 (PF4) on bone marrow stromal cells (BMSCs) of radiated
2、mice and to study the protective mechanism of hematopoietic radiation injury in mice. METHODS: Forty male mice were randomized to four groups (R, R+P, N+P and N) and two of groups (R, R+P) were exposed wholebodily to 5.0 Gy 60Co rays. The mice were treated with injections of PF4 (50g/ kg), ip twice
3、at an interval of 6 h and 20 h. After the second injection, they were irradiated. The cell cycle and apoptosis of bone marrow stromal cells (BMSCs) cultured in vitro after radiation were analyzed by FACS after ten days culture. The expression of 2p27kip1 in the cells was detected using immunohistoch
4、emistry. RESULTS: The 24th hour adhesion rate of BMSC in radiated mice respectively reached 37%, 58%, 74% and 79.3%. The cell percentage of G0+G1 phase increased and those of G2+M decreased in R group, compared with those in R+P, N+P and N groups. But the DNA content of the radiated group of BMSC de
5、creased remarkably compared with those in the other three groups. The expression of p27kip1 was downregulated compared with that of BMSC without PF4 protection. CONCLUSION: The protective effects of PF4 on BMSCs with radiated injury probably result from the inhibition of the expression of p27kip1.【K
6、eywords】 marrow stromal cells; platelet factor 4; radiation injuries; radiatior protection; p27【摘要】 目的： 探讨血小板第 4 因子(platelet factor 4, PF4)对小鼠 5.0 Gy 射线全身照射后骨髓基质细胞（bone marrow stromal cell, BMSC）的保护作用，进一步探讨 PF4 对造血的辐射防护机制. 方法： 40 只雄性小鼠随机分为 4 组： 单纯放射组（R） ， 放射PF4 组（R+P） ， 正常PF4 组3（N+P） ， 正常对照组（N）. 小鼠照
7、射前分别于 26 和 20 h ip PF4，每次剂量 50 g/ kg. 于照射后 3 d 取 BMSC 体外培养，倒置显微镜下观察贴壁细胞生长状况，并于培养 10 d 后用流式细胞仪测定贴壁细胞的细胞周期和 DNA 含量，免疫组化（SP 法）检测细胞 p27kip1 表达. 结果： 放射损伤小鼠 BMSC 24 h 贴壁率 4 组依次为 37, 58%, 74%, 79.3%；流式细胞仪检测结果表明 R 组G0+G1 期细胞显著高于其余 3 组，而 G2+M 期细胞显著低于其余三组，DNA 含量显著低于其余 3 组；R 组 p27kip1 表达明显强于其余 3 组. 结论： PF4 对放射
8、损伤的 BMSC 有保护作用，可能与抑制 p27kip1 表达有关.【关键词】 骨髓基质细胞；血小板因子 4；辐射损伤；辐射防护；p270 引言造血功能障碍是放射损伤时最基本的病理变化. 此时的造血功能障碍涉及造血干/祖细胞和造血基质细胞损伤 . 骨髓基质细胞(bone marrow stromal cell, BMSC)是造血诱导微环境(hematopoietic inductive microenvironment, HIM)的重要组成成分. 血小板第 4 因子(PF4) 能可逆地抑制造血干细胞、祖细胞的生长，又是骨髓细胞调节的负调节因子,并因此而保护骨髓造血干祖细4胞免受辐射和细胞毒剂的
9、损伤1，2 . 在本实验中我们首次以体外培养放射损伤小鼠的 BMSC 为基础，观察 PF4 对其的保护作用，进一步探讨 PF4 对放射损伤的保护机制.1 材料和方法1.1 材料BABL/c 健康雄性小鼠 40 只，体质量 2224 g，第四军医大学实验动物中心提供；RPMI1640 培养基（Gibco ） ；PF4（ Sigma）：用双蒸水稀释成工作液,置 4冰箱保存备用,稀释浓度为 100 mg/L；特级小牛血清、马血清（杭州，四季青） ；胰酶（Sigma） ； P27kip1, SP 试剂盒及 DAB 显色试剂盒（武汉博士德）.1.2 方法 60Co 射线一次全身均匀照射,吸收剂量为 5.
10、0 Gy,吸收剂量率为 221.09 cGy/min，距离 100 cm. 实验随机分 4 组，每组 10只小鼠： 单纯放射组（单放组，R）： 5.0 Gy 60Co 射线全身照射；放射PF4 组（R+P）： 放射前 26 和 20 h 给予 PF4 ip，50 g/kg，照射方式和剂量同组；正常PF4 组（N P）：5PF4 注射时间及剂量同组，但不照射；正常对照组（N）： 不照射及 PF4 注射. BMSC 原代培养参照 Dexter 方法3： BABL/c 小鼠颈椎脱位处死, 在无菌条件下分离双侧股骨,冲洗骨髓腔,制成单细胞悬液. RPMI1640 培养体系中含 100 mL/L 新生牛
11、血清，150 mL/L 马血清，青、链霉素 100 kU/L, 1 mol/L 氢化考的松, 50 mL/L CO2 饱和湿度,37条件下扩增 BMSC. 第 1 次 3 d 后半量换液，以后每隔 5 d 半量换液. 在倒置显微镜下观察细胞生长状态及细胞形态. 取 25 mL 的培养瓶，各组 6 个，接种细胞 5105/瓶，每 4 h 取 1 瓶，倒去培养液，2.5 g/L 胰酶消化，计数贴壁细胞，计算每个时间点的贴壁率（贴壁率已贴壁细胞数/接种细胞数100%）. 将各组 BMSC 用 2.5 g/L 胰酶消化后生理盐水制成单细胞悬液，700 mL/L 乙醇固定,溴化丙啶染色,用流式细胞仪分析
12、细胞周期和 DNA 含量. 另 p27kip1 表达的免疫组化染色（SP 法）：BMSC 2109/L 接种于孔底预先铺好 1 cm2 经过酸处理过的细胞玻璃爬片的 24 孔板，经完全培养基培养 10 d 后取出玻片，950 mL/L 乙醇固定，严格按照说明书操作. 行 HE 染色对照. 用 PBS 替代一抗作为阴性对照.统计学处理：实验结果均以 xs 表示，使用 SPSS10.0 软件，均数间差别用单因素方差分析，均数间多重比较使用 LSDt 检验.2 结果62.1BMSC 形态和贴壁率刚接种的 BMSC 呈圆形，大小不一；d 3 更换培养液时，各组细胞形态有差别：R 组贴壁细胞数量较少，无
13、成纤维样细胞形成；RP 组可见散在分布的贴壁细胞克隆，有成纤维样细胞出现；N+P 组细胞形态多样，呈三角形、圆形、成纤维样；N 组细胞形态同 N+P 组. 710 d，R 组散在分布贴壁细胞克隆，形态以圆形为主，少量成纤维样；R+P 组成纤维样细胞数量明显多于 R 组；NP 组成纤维样细胞明显增多，呈集落样生长；N组成纤维样细胞较 NP 组多，且连接成片 . 4 组 BMSC 24 h 贴壁率依次为 R 组 37%，R+P 组 58%，N+P 组 74%，N 组 79.3%.2.2 细胞周期和 DNA 含量 R 组的 G0+G1 期细胞显著高于R+P 组，G2+M 期细胞显著低于 R+P 组；
14、而 N+P 组与 N 组均无显著差异. DNA 含量 R 组明显低于其余 3 组（Tab 1）.表 15.0 Gy照射后 BMSC 的细胞周期和 DNA 含量（略）2.3p27kip1 蛋白表达胞质可见弥漫散在棕色颗粒为p27kip1 蛋白阳性表达,胞核无阳性表达. R 组胞质棕色颗粒较其余3 组明显多，即 p27kip1 过度表达(Fig 1).3 讨论7造血微环境中的基质细胞发生各种损伤时,则有可能对维持正常的造血过程产生不同程度的影，且一旦受到损伤,其功能障碍和(或)其增殖能力损伤的修复甚为困难,机体造血功能的恢复也必然受到严重的影响. 因此,在辐射损伤引起的严重造血障碍中,基质细胞的功
15、能障碍可能起着非常重要的作用4. 一般认为,造血基质细胞的辐射敏感性低于造血干细胞. 本实验提示： PF4 可能具有保护基质细胞的黏附功能的能力5 .对于放射损伤后骨髓基质细胞周期分析的研究报道很少,而有关 PF4 对其影响的研究更缺乏可比性的资料. 在本实验中，R 组G0+G1 期细胞显著高于其余 3 组，说明放射损伤使 BMSC 产生了 “G1 期阻滞” ；同时辐射对 DNA 直接造成了损伤，使 BMSC DNA 含量减少；而 R+P 组 S 期细胞增加，这同 Kitajima 等6的研究结果相同. 也同 PF4 对造血细胞的保护机制相同，将细胞阻滞于 S 期7.p27 可抑制多种 cyc
16、linCDK 复合物的活性 , 对细胞周期进行负调控. 我们发现该蛋白在 R 组高表达，且阳性表达于细胞质，而R+P 组的表达与其它组有显著差异，这与放射损伤造成 R 组基质细胞“G1 期阻滞”相一致. 另外，我们还发现 PF4 对正常 BMSC无明显的保护作用. 总之本研究证实了放射损伤对 BMSC “G1 期阻滞” ，阐明了 PF4 对放射损伤的 BMSC 的保护机制，也进一步证8实了基质细胞在造血防护中的重要地位，为临床造血防护的治疗方案提供帮助.【参考文献】1 田琼，杨岚，张发科，等. 血小板第 4 因子对小鼠急性照射小鼠造血保护作用的实验研究J. 中华血液学杂志，2000;20（ 6）:416-418.Tian Q, Yang L, Zhang FK, et al. Protective effect of platelet factor 4 on acute he
