《耐亚胺培南铜绿假单胞菌CARB-3基因的发现》由会员分享，可在线阅读，更多相关《耐亚胺培南铜绿假单胞菌CARB-3基因的发现（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1耐亚胺培南铜绿假单胞菌 CARB-3 基因的发现铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）是临床常见的条件致病菌，由于其固有和获得性耐药，使临床治疗成为一大难题。CARB 基因编码产生羧苄西林酶，为 -内酰胺酶 Bush 分类中的2c，在我国 CARB 基因、流行基因亚型的研究未见报道。我们研究分析了 2005 年 112 月临床分离的 34 株耐亚胺培南铜绿假单胞菌（IMPRPa） ，发现了我院 IMPRPa 携带 CARB-3 基因，现总结报告如下。1 材料与方法1.1 菌株来源与质控菌株 34 株耐亚胺培南铜绿假单胞菌来自于 2005 年 112 月我院住院病人
2、的临床分离标本（包括：痰液、尿液、伤口分泌物、脓液、血液等） ，质控菌株包括：铜绿假单胞菌ATCC27853，大肠埃希菌 ATCC25922。1.2 菌株鉴定及亚胺培南耐药菌株筛选 试验菌株经 BD Phoenix100 全自动微生物分析仪鉴定到种，采用该仪器配套药敏试验复合板筛选亚胺培南耐药的 Pa。21.3 主要仪器设备与试剂 Eppendorf centrifuge 5417R 低温离心机，恒温金属浴（杭州大和） ，MJ Peltier Thermal Cycler（MJ Research） ，Bio-RAD 电泳仪，Bio-RAD 凝胶成像系统， 琼脂糖（OXOID ） ，100bp
3、DNA Ladder Marker（大连宝森），6Loading buffer（北京天为时代） 。 1.4 模板 DNA 提取 采用蛋白酶 K 消化法。1.5 基因扩增 引物序列为：P1：5-AAA GCA GAT CTT GTG ACC TATTC -3，P2： 5-TCA GCG CGA CTG TGA TGT ATA AAC -3，扩增产物为 588bp。热循环参数为：93 预变性3min，93 60s，55 60s，72 60s，最后一个 72 延伸5min，共循环 35 周期。纯水为阴性对照。耐药基因检测试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供。1.6 结果判断 取 10l 扩增产物与
4、2l 6上样缓冲液混匀，点样于 1.5%琼脂糖凝胶，在 100V 电压电泳 30min，出现 588bp3的条带即为 CARB 基因阳性。用凝胶成像系统观察并照相。1.7 序列分析 PCR 产物经纯化后送上海生工生物工程公司进行 DNA 序列分析，测得序列在 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST 中的 BLASTn 程序进行同源性和基因亚型分析。2 结果2.1 CARB 基因 PCR 检测结果 34 株耐亚胺培南铜绿假单胞菌共检出 11 株 CARB 基因阳性株，检出率为 32.4%，PCR 扩增结果见图 1。2.2 序列分析结果 任意抽取 5 株 CARB 基因阳性的 PCR
5、 扩增产物进行单向测序，测得序列与 GenBank 中注册号为DQ309773 的 CARB-3 基因完全同源（Identities=100%） 。因此我院流行的 CARB 基因亚型为 CARB-3 型。图 1 部分 Pa 菌株 CARB 基因 PCR 产物电泳图（略）43 讨论CARB 基因最早于 1981 年在 Pa 中发现1 ，近年又从不动杆菌、弧菌属、奇异变形杆菌中检出，已发现 CARB1-9 型 9 个亚型24 。我院 IMPRPa 的 CARB 基因携带率为 32.4%，提示医务工作者应重视和加强 Pa 的防治和耐药监测。对 CARB 基因阳性菌株进行 DNA 序列分析，经同源性比
6、较，结果显示：我院流行的CARB 基因亚型为 CARB-3 型。IMPRPa 中 CARB 基因检出、CARB-3 基因亚型发现为国内首次报道。铜绿假单胞菌是临床常见的条件致病菌，正常情况下不感染人体任何组织，但当人体免疫力下降或严重创伤或医疗操作后，Pa几乎可以感染人体的任何组织，临床可表现为局部化脓性炎症和全身性感染，常常危及患者生命。碳青霉烯类抗生素（如亚胺培南）因其独特的抗菌优势，被临床广泛用于 Pa 引起的重症感染，导致临床分离株对亚胺培南耐药性增加。5Pa 对亚胺培南耐药的机制主要有膜孔蛋白缺失、外排泵和产酶等三种机制5 。我们对 IMPRPa 的耐药机制的相关研究正在进行中。【参
7、考文献】1 Paul G,Joly G ML,Bergogne BE,et al.Novel carbenicillin-lydrolyzing -lactamases(CARB-5)from Acinetobacter calcoaceticus var.anitratus.FEMS Microbiol Lett， 1989,50(1-2):45.2 Alejandro P,Roberto G M,Hector AS,et al.CARB-9 a carbenicillinase encoded in the VCR region of Vibrio cholerae Non-O1,Non-
8、O139belongs to a family of cassette-encoded -lactamases.Antimicrob Agents Chemother，2004,48(10):4042.3 Nucleotide sequence of the blaRTG-29CARB-5) gene and phylogeny of a new group of carbenicillinases.Antimicrob 6Agents Chemother，2000,44(4):1070.4 Bert F,Branger C,Lambert-zechovsky N.Comparative ac
9、tivity of beta-lactam agents (carbapenem excepted)against Pseudomonas aeruginosastrains with CARB or OXA beta-lactamASES.Chemotherapy，2004,50(1):31.5 Okamoto K,Gotoh N,Nishino T.Pseudomonas aeruginosa reveals high intrinsic resistance to penem antibiotics:penem resistance mechanisms and their interplay.Antimicrob Agents Chemother,2001,45(7):1964.
