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1、1维生素 E 琥珀酸酯下调 mdr1/Pgp表达逆转K562/ADM 耐药细胞的凋亡抑制作者：郭璐，魏虎来， 张亚莉， 刘建民【摘要 】 目的 研究维生素 E 琥珀酸酯（Vitamin E succinate, VES）诱导多药耐药 K562/ADM 细胞凋亡的分子机制。方法 采用四氮唑蓝比色法（MTT ）检测 K562/ADM 增殖活性；细胞形态学和 Annexin V/PI 双标记法检测细胞凋亡； RTPCR 检测mdr1 基因和 Caspase3 基因 mRNA 的表达；流式细胞法（FCM ）测定 Pgp 蛋白表达水平和 Caspase3 活性。结果 VES显著抑制 K562/ADM 细
2、胞的增殖；经 VES 处理后细胞形态上出现典型的凋亡改变；Annexin /PI 双染检测凋亡细胞明显增加；mdr1 mRNA 表达和 P糖蛋白（Pglycoprotein ，Pgp ）合成明显降低，Caspase3 mRNA 表达和 Caspase3 活性显著增强；VES 增加 K562/ADM 细胞对 ADM 的敏感性。结论 VES 诱导mdr1/Pgp 高表达的 K562/ADM 耐药细胞凋亡，其主要机制为下调 mdr1/Pgp 表达而逆转 Pgp 介导的细胞凋亡抑制和耐药性。 【关键词】 维生素 E 琥珀酸酯多药耐药 凋亡抑制P 糖蛋白；Caspase3 ；白血病2Key words：
3、Vitamin E succinate; Multidrug resistance; Apoptosis resistance; Pglycoprotein; Caspase3; Leukemia维生素 E 琥珀酸酯（Vitamin E succinate, VES）是 生育酚的 6 位羟基与琥珀酸酯化而形成的衍生物。研究证实，VES 可选择性地杀伤人白血病、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤细胞，而对正常细胞无抑制效应13 。有关 VES 对耐药白血病（肿瘤）细胞作用的研究少见，我们曾研究证实 VES 可抑制白血病 K562/ADM 耐药细胞增殖并诱导其凋亡4。本文以白血病多药耐药 K562/ADM
4、细胞为模型，观察 VES 诱导其凋亡过程中耐药基因 mdr1 及其编码产物 P糖蛋白（ Pglycoprotein，Pgp ）表达的变化，探讨 VES诱导耐药细胞凋亡的分子机制。1 材料和方法1.1 试剂维生素 E 琥珀酸酯（Vitamin E succinate, VES）为美国 Sigma公司产品，用无水乙醇配制成 50 mmol/L 的储存液。RPMI1640为美国 Gibco BRL 公司产品；新生牛血清购自杭州四季清生物工程材料研究所。阿霉素（ADM）为日本明治制药公司产品。MTT、SDS、琼脂糖、 RNase、溴化丙锭（EB） 、碘化丙啶（PI）3和二乙基焦碳酸（DEPC ）均由美
5、国 Sigma 公司出品。100bp DNA Ladder Marker 由美国 Promega 公司出品。抗 Pgp 单抗（MRK16）为 Kamiya Biomedical 公司产品，PE 标记的羊抗鼠IgG2a 为 Caltag 公司产品。TRIZOL 试剂由美国 Invitrogen 公司生产。AMV 一步法 RTPCR 试剂盒购自上海生物工程有限公司。mdrl、Caspase3 和 actin 基因引物由上海生物工程有限公司合成。FITC 标记的 DEVDFMK 和 Annexin V 试剂盒为 Biovision公司产品。1.2 细胞培养K562/ADM 多药耐药白血病细胞由兰州大
6、学医学实验中心保存，细胞在含有 15%小牛血清、100u/ml 青霉素、100g/ml 链霉素和2mmol/L L谷氨酰胺的 RPMI1640 完全培养基中，置 37 、5%CO2 孵箱中培养，定期添加 ADM（ 5.0mg/L）以刺激mdr1/Pgp 高表达。细胞在无 ADM 的条件下培养 1 周后用于实验。1.3 细胞增殖活性K562/ADM 细胞以 2108/L 接种于 96 孔培养板（Costar）中，分别加入 1060mol/L VES，对照组加入终浓度40.2%（V/V）的无水乙醇。培养 2496h 后 MTT 比色法5检测，并计算细胞增殖抑制率和半数抑制浓度（IC50） 。1.4
7、 细胞形态学观察VES 处理后的 K562/ADM 细胞，细胞离心涂片机（StatSpin Cytofuge 2 型）离心涂片，WrighGiemsa 染色，光镜观察。同时收集细胞，3%戊二醛固定，经脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，铀铅双重染色，透射电镜（JEM1230 ）观察细胞超微结构。1.5 Annexin /PI 双标记检测凋亡细胞按试剂盒说明操作。收集 K562/ADM 细胞，PBS 洗涤，重悬于Binding Buffer 中，加入 PI 和 FITC 标记的 Annexin ， 室温避光染色 5min，流式细胞仪（BeckmanCoulter Epics XL）检测6 。1.6 R
8、TPCR 检测 mdr1 和 Caspase3 基因 mRNA 表达TRIZOL 法提取细胞总 RNA，以 actin 为内参照，AMV 一步法 RTPCR 检测 mdr1 和 Caspase3 基因 mRNA 表达情况。引物分别为：mdr1：上游 5CCCATCATTGCAATAGCAGG3 ，5下游 5GTTCAAACTTCTGCTCCTGA3 ，扩增产物167bp；Caspase3: 上游 5CAAACTTTTTCAGAGGGGATCG3 ，下游 5GCATACTGTTTCAGCATGGCAC3 ，扩增产物 272 bp；actin ：上游 5GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3
9、，下游 5CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3 ，扩增产物548bp。PCR 扩增产物凝胶电泳，凝胶图像分析系统（Syngene ChemiGenius 2）分析。1.7 Pgp 表达测定收集 K562/ADM 细胞，PBS 洗涤，分别加入鼠抗人 Pgp 单抗MRK16（一抗）和 PE 标记的羊抗鼠 IgG2a（二抗） ，FCM 检测Pgp 的表达阳性率和平均荧光强度（MFI）7。1.8 Caspase3 活性测定根据试剂盒说明操作。收集细胞，PBS 洗涤，加入FITCDEVDFMK，37孵育 1h，洗涤，FCM 检测活化Caspase3 活性8 。1.9 药物敏感性6K562/
10、ADM 细胞经 20mol/L 和 40mol/L VES 与不同浓度的ADM 联合处理 48h，细胞终止培养后 MTT 比色法5 检测并计算细胞增殖抑制率。1.10 统计学分析采用 SPSS10.0 统计软件进行相关性分析和直线回归。2 结果2.1 VES 诱导 K562/ADM 细胞凋亡VES 呈时间和浓度依赖性地抑制 K562/ADM 细胞增殖（P0.01） ， 24h、48h、72h 和 96h 的 IC50 分别为77.9mol/L、66.3mol/L、49.7mol/L 和 39.9mol/L。经20mol/L 和 40mol/L VES 处理后，K562/ADM 细胞出现胞膜起泡
11、，染色质凝集、核碎裂及凋亡小体形成等典型的凋亡形态学改变，见图 1。Annexin V/PI 染色显示凋亡细胞明显增高， 20mol/L 和40mol/L VES 处理 24h 细胞凋亡率分别为 29.0%和 54.7%，48h为 60.8%和 74.8%。证实 VES 对 K562/ADM 细胞有明显的增殖抑制效应，并促使细胞凋亡。72.2 VES 下调 K562/ADM 细胞 mdr1 mRNA 表达，抑制 Pgp合成 K562/ADM 细胞 mdr1/Pgp 呈高表达。20mol/L 和40mol/L VES 后， mdr1 mRNA 表达下降，凝胶图像分析，48h的表达抑制率分别为 8
12、.78%和 46.54%，见图 2； Pgp 合成显著降低，72h 时 Pgp 表达阳性率由 98.2%降低至 87.8%75.1% ，表达强度（MFI）降低约 50%，见图 3。2.3 VES 上调 K562/ADM 细胞 Caspase3 基因 mRNA 的表达，增强 Caspase3 活性 K562/ADM 细胞 Caspase3 基因 mRNA呈微弱表达。经 20mol/L 和 40mol/L VES 处理，Caspase3 mRNA 表达明显增高，凝胶图像分析显示分别增高 24.3%和84.3%，见图 2；Caspase3 活性显著增强，活化 Caspase3 由9.3%增高至 21
13、.3%和 39.8%，见图 3。2.4 VES 增加 K562/ADM 细胞对 ADM 的敏感性20mol/L 和 40mol/L VES 与不同浓度 ADM 共同作用 48h，对 K562/ADM 细胞产生联合增殖抑制效应（P0.05） ，见图4。VES 与 ADM 的联合效应可能是 VES 抑制 K562/ADM 细胞Pgp 表达，提高耐药细胞对抗癌药物 ADM 的敏感性，逆转细胞抗药性和凋亡抑制。8白血病多药耐药（Multidrug resistance，MDR）的发生均伴随着细胞凋亡抑制（Apoptosis resistance）现象，绝大多数常规抗癌药物几乎不能诱导耐药细胞凋亡。K5
14、62/ADM 细胞是经阿霉素（ADM）长期诱导而获得的 mdr1/Pgp 超表达的白血病耐药细胞，对 ADM、柔红霉素（DNR） 、米托蒽醌（MIT） 、高三尖杉酯碱（HHT）和足叶乙甙（Vp16）等抗癌药物表现出复杂的交叉耐药9。近年研究发现，Pgp 除作为一种能量依赖“药泵”主动性地将药物从细胞内排出而导致耐药外，还通过抑制 Caspase3 和Caspase8 等的激活而介导耐药细胞的凋亡抑制7,10,11，因此，Pgp 在白血病耐药细胞凋亡抑制的发生中起着关键作用。维生素 E 琥珀酸酯（VES ）作为一种潜在的肿瘤细胞生长抑制剂，其抗肿瘤作用机制包括抑制肿瘤细胞 DNA 合成，诱导凋亡
15、；阻断细胞周期使肿瘤细胞停滞于 G1 期；诱导细胞分化；促进转化生长因子 （transforming growth factor , TGF）分泌与活化及TGF 型受体的表达；促进肿瘤细胞表面 Fas（CD95/APO1 ）的表达等13,12 。我们以前的研究证实 VES 可抑制耐药白血病细胞增殖，并诱导其凋亡4。白血病细胞发生 MDR 后，其生物学特性发生了很大的变化，因此，VES 诱导耐药细胞凋亡的机制也可能异于药物敏感细胞。本研究发现，VES 诱导 K562/ADM 耐药细胞凋亡过程中，mdr1 mRNA 表达水平和 Pgp 合成量显著降低，而Caspase3 mRNA 表达水平和 Caspase3 活性则明显增高，呈剂9量和时间依赖性；同时发现 VES 可显著提高 K562/ADM 细胞对ADM 的敏感性。鉴于 Pgp 在白血病耐药细胞耐药性和凋亡抵抗中的关键作用，我们的研究结果提示 VES 诱导白血病耐药细胞凋亡的机制与其抑制 mdr1/pgp 表达，解除 Pgp 对 Caspase3 等的抑制效应，并增加抗癌药物的敏感性，从而逆转因 Pgp 高表达所介导的凋亡抑制和细胞耐药有关。多药耐药白血病（肿瘤）细胞的凋亡抵抗现象和干预对策是目前肿瘤耐药研究的热点之一，鉴于维生素 E 及其衍生物的特性，深入研究其在干预白血病（肿瘤）耐药细胞凋亡抑制的作
