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1、1白藜芦醇抑制人脑胶质瘤细胞生长及诱导凋亡比较作者：常洪波,章翔, 甄海宁 ,费舟,曹卫东【摘要 】 目的 探讨白藜芦醇（Resveratrol，Res ）体外抑制U251、U87 和 SHG44 脑胶质瘤细胞生长及诱导凋亡的不同作用比较，验证 Res 确可导致 U251 细胞凋亡。方法 MTT 比色法测量不同剂量的 Res 作用 U251、U87 和 SHG44 胶质瘤细胞 24h 后对增殖的影响及不同剂量的 Res 作用 U251、U87 和 SHG44 细胞6h、24h 、 48h 后的影响。流式细胞仪用 Annexin VFITC 和 PI 双染检测 U251、U87 和 SHG44
2、细胞凋亡率。 HE 染色、Hoechst 33342 荧光染色、透射电镜(TEM) 观察 U251 细胞形态改变，流式细胞仪测定 U251 细胞的细胞周期改变。结果 Res 明显抑制U251、U87 和 SHG44 细胞的生长和增殖（ P0.01）且对 U87细胞的抑制作用最强，U251 和 SHG44 细胞次之；对 U251 细胞的抑制作用呈浓度及时间依赖性反应；Res 所致的 U251 、U87 和SHG44 胶质瘤细胞凋亡为浓度依赖关系，且对 U87 细胞的凋亡作用强于 U251 和 SHG44 细胞。U251 凋亡细胞的细胞周期主要发生 G1 期阻滞。结论 Res 对 U251、U87
3、 和 SHG44 细胞生长抑制及凋亡作用以 U87 细胞更明显，对 U251 细胞的抑制作用呈浓度及时间依赖性反应并引起了其细胞周期改变。 2【关键词】 白藜芦醇；胶质细胞瘤；细胞凋亡Comparison Study on Resveratrol Suppressing Human Glioma Cells Growth and Inducing ApoptosisKey words：Resveratrol； Glioma； Apoptosis0 引言Res 是一种多酚类化合物，化学名为 3，5 ，4 三羟基 反 均二苯代乙烯(3，5，4trihydroxystilbene, C14H12O3
4、)，分子量228.2 1。近年来对其抗肿瘤作用研究较广泛。本研究旨在证明Res 可抑制人源脑胶质瘤细胞系 U251 生长并导致其发生凋亡及细胞周期改变，探讨生长抑制与剂量、时间及凋亡与剂量的关系，并与 Res 抑制 U87 及 SHG44 脑胶质瘤细胞生长及诱导凋亡的作用比较。1 材料与方法1.1 材料3Res 购自 Sigma 公司，用 DMSO 溶解配成 200 mmol/L 贮存液-20冻存备用； U251、U87 和 SHG44 细胞系由本研究所提供；DMEM 培养基购自 Gibico 公司；胎牛血清购自灏洋生物公司；MTT、Hoechst 33342 荧光试剂盒、Annexin VF
5、ITC 和 PI 均为Sigma 公司产品。1.2 方法1.2.1 细胞培养U251、U87 和 SHG44 细胞在含 10%胎牛血清的 DMEM培养液中，置于 37、5% CO2 孵箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。1.2.2 MTT 法实验首先进行 3 种细胞 Res 处理 24h 的生长状态比较，取对数生长期 U251、U87 和 SHG44 细胞，接种至 96 孔板内；实验按 3 种细胞分 3 组，每组将 Res 分 7 个不同浓度梯度，分别为5、25 、50、100、200、300、400molL 的处理组及浓度为0molL Res 的等量 DMSO 的对照组，每种浓度设 6 个
6、重复孔，并以空白孔调零。各组细胞培养 24h 后，将培养液换成含不同浓度4Res 的培养液，继续培养 24h，随后每孔加入 20l、5g/L 的MTT，继续培养 4h，最后每孔加 150l DMSO 振荡 10min，酶标分析仪检测 490nm 波长的光密度值(Optical density，OD)。其次按照同样方法进行 Res 处理 U251、U87 和 SHG44 细胞6h、24h 、 48h 的分组及其细胞生长状态的 MTT 法 OD 值测量。所得数据用 SPSS 10.0 软件计算均数及标准差，并进行方差分析，组间差异采用 Dunnettt 检验。1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期及
7、Annexin VFITC 和 PI双染检测细胞凋亡率消化收集 200mol/L Res 处理 24h 的 U251 细胞及对照组细胞，调整细胞浓度 1106 /ml 各取 4ml，按常规细胞周期样品检测方法作程序性处理后进行流式细胞仪检测；分别消化收集300、 150、 50、5mol/L Res 处理 24h 组的 U251、U87 和SHG44 细胞和 DMSO 对照组的细胞，加入 5l Annexin VFITC和 5l PI 于细胞悬液中避光染色 10min，流式细胞仪检测凋亡的百分比，数据用 multicycle 分析软件处理。1.2.4 凋亡细胞的光镜观察将 U251 传代细胞接
8、种于盖玻片表面，培养 24h 后，换成含5200mol/L Res 的 DMEM 培养液，继续培养 24h 后，HE 染色，光镜观察。1.2.5 凋亡细胞的 Hoechst 33342 荧光检测200mol/L Res 处理 24h 的 U251 细胞按荧光染色试剂盒方法逐步进行后荧光显微镜下摄片。1.2.6 凋亡细胞的 TEM 观察消化收集 200mol/L Res 处理 24h 的 U251 细胞，细胞计数 1106 107，1 500r/min 离心 15min 后，4%戊二醛固定，按常规 TEM 样品作程序性处理，行 TEM 观察。1.3 统计学分析采用 SPSS10.0 统计软件进行
9、分析，计量资料结果采用(s)表示，组间均数的比较用 t 检验分析和方差分析。2 结果2.1 Res 所致 U251、U87 和 SHG44 细胞的细胞毒性效应比较6通过设计的 MTT 实验，首先比较了 Res 对 U251、U87 和SHG44 细胞生长的抑制效果，见图 1。随着 Res 作用浓度的增加、作用时间的延长，胶质瘤细胞受抑制作用越显著，从左到右的生长曲线分别为 U87、U251 和 SHG44 细胞，可以看到 U87 细胞在同种浓度下的受到抑制更明显，存活率更低；MTT 法分析存活率，当前存活率=同一浓度处理组 OD 值均值/DMSO 对照组 OD 值均值100%，设 DMSO 对
10、照组存活率为 100%。其次 Res 作用 6h、24h 、48h 后的 U251、U87 和SHG44 细胞的存活率见图 2，Res 引起的 3 种胶质瘤细胞生长抑制作用有浓度和时间的依赖关系，且有显著差异（P0.01） 。2.2 Res 导致细胞凋亡的流式细胞仪分析经 300mol/L、150mol/L、50mol/L Res 处理 24h 后和DMSO 对照组的 U87、SHG44 和 U251 细胞的凋亡率（包括早期及晚期凋亡）分别为52.2%、38.6%、24.4%、2.3%、40.5%、34.4% 、22.7% 、2.5%、43.8%、37.1%、23.3%、2.1%，有浓度依赖关
11、系。3 种细胞的凋亡率比较，可见不同浓度的 Res 作用后的凋亡率U87U251SHG44 ，与 MTT 法测得的抑制率结果相一致。DMSO 对照组及 150molL Res 处理组的 U251 胶质瘤细胞的凋7亡分布图，见图 3A、B。U251 的细胞周期改变， G1、G2、S 期的细胞对照组分别占 69.5%、2.7%、27.8%，200mol/L Res 处理组分别占 76.4%、2.2%、21.4%。G1 期比例升高，S、G2 期比例降低，见图 3C、D。2.3 形态学结果2.3.1 HE 染色光镜下观察所见 U251 凋亡细胞，细胞变圆、细胞核固缩、深染，核染色质致密，形状不一、大小
12、不等的团块边集于核膜。2.3.2 Hoechest 33342 染色 U251 凋亡细胞的荧光染色高倍镜下观察结果，可见凋亡细胞，细胞核固缩，核染色质边集，荧光信号强，见图 4。2.3.3 透射电镜观察凋亡的 U251 细胞表面绒毛消失，表面光滑，细胞膜表面有出泡现象，线粒体崩解，胞质浓缩，染色质晚期碎裂，边集。83 讨论Res 是普遍存在于葡萄属植物中的一种物质，是一种多酚类化合物，已在 72 种植物中被发现。对 Res 药理作用的认识最早源自其具有抗脂质过氧化作用。近年对 Res 抗肿瘤活性机制的研究揭示，其在肿瘤启动、促进及发展 3 个阶段都有抗肿瘤功效。目前提出的Res 抗肿瘤途径有很
13、多种，但机制还不是很清楚。本实验证实 Res对 U251 肿瘤细胞的抑制率大于凋亡率更大于死亡率，说明 Res 导致凋亡作用不是唯一途径。我们主要对 Res 导致 U251 细胞凋亡及引起其细胞周期改变进行研究，证实 Res 阻滞 U251 胶质瘤细胞的细胞周期从 G0/G1 期进入 S 期，导致了 S 期减少，并且根据文献报道 Res 可通过抑制人脑胶质瘤 U251 细胞 2、人乳腺癌MCF7 细胞 3的细胞周期蛋白 cyclin D1 表达，导致细胞周期G0/G1 阻滞，并应用周期素依赖性蛋白激酶抑制剂可以抑制 Res 导致的凋亡 2，由此考虑细胞周期的阻滞可能促进了 Res 导致的凋亡性
14、死亡，引起了肿瘤细胞生长抑制，但是其确切的作用机制还有待我们深入的研究。本研究证明 Res 对 U251 胶质瘤细胞的生长抑制呈浓度和时间依赖关系，这与我们以前对 SHG44 4、U87 5细胞的实验结果一致，也与文献对 RT2 胶质瘤 6、乳腺癌 3、前列腺癌 7等的报道结果一致。同时，我们也证明了 Res 对人源 U251、U87 和9SHG44 胶质瘤细胞产生明显的凋亡作用，与其引起其他肿瘤细胞发生凋亡 6，8的结果有相似性，都有浓度依赖关系。本实验又证实 Res 对 U251、U87 和 SHG44 细胞生长抑制及凋亡作用以U87 细胞最明显，这样我们以后可以采用更为敏感的 U87 细
15、胞进行机制研究及动物实验。另外，实验中用于溶解 Res 的溶剂为稀释至1的 DMSO 溶液，对细胞不具有毒性作用，Res 对正常细胞及3T3 成纤维细胞没有明显毒性作用 6，8 。以上实验证明了 Res 确可抑制人源 U251 胶质瘤细胞增殖并诱导凋亡，并筛选出了对 Res 更为敏感的 U87 细胞作为以后机制研究的细胞系。我们认为加强 Res 的抗癌耙点研究，可以为临床开发新药物提供理论依据。同时我们认为 Res 作为一种天然药物比传统化疗药物有优势，有着很好的应用前景。 （本文图 4 见第 318 页）【参考文献】1Soleas GJ, Diamandis EP, Goldberg DM
16、. Resveratrol: a molecule whose time has come and gone？ J.Clin Biochem, 1997, 30(2): 91113.2 Jiang H, Zhang LJ, Kuo J, et al. Resveratrolinduced apoptotic death in human U251 glioma cells J. Mol Cancer Ther, 2005, 4(4): 554561.103 Kim YA, Choi BT, Lee YT, et al. Resveratrol inhibits cell proliferation and induces apoptosis of human breast carci
