《甲基化修饰对人宫颈癌细胞系中FHIT基因的调控》由会员分享，可在线阅读，更多相关《甲基化修饰对人宫颈癌细胞系中FHIT基因的调控（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1甲基化修饰对人宫颈癌细胞系中 FHIT 基因的调控【摘要 】 目的探讨 FHIT 在子宫颈癌发生中的作用及 FHIT 基因失活的机制。方法培养宫颈癌细胞 C33A、HeLa、CasKi、SiHa 及人脐静脉血管内皮细胞 ECV304，进行 5azadC 干预前后FHIT 基因在 5 株细胞中的甲基化分析，并通过逆转录聚合酶链式反应和免疫荧光化学染色方法检测 5azadC 干预前后 FHIT 基因在5 株细胞中的表达。结果 4 种宫颈癌细胞均存在 FHIT 基因的甲基化，正常对照细胞 ECV304 在 5azadC 干预前后均未见明显 FHIT基因扩增产物。4 株宫颈癌细胞在 5azadC 化
2、学干预前均未见明显 FHIT 的荧光着色，而干预后的细胞胞浆中可见 FHIT 的表达强度明显增强，尤其在 106M 及 2106M 干预浓度下的表达最强(P0.05)。结论 FHIT 基因的甲基化在宫颈癌中是频发事件，甲基化可能是 FHIT 基因沉默及宫颈癌发生的重要机制。 【关键词】 脆性组氨酸三联体基因（FHIT） ；人宫颈癌细胞系；5azadC；DNA 甲基化；免疫荧光2Pattern of FHIT Gene 5 CpG Island Methylation Contribute to Human Cervical Carcinoma Cell TumorigenesisAbstrac
3、t：Objective To determine whether hypermethylation of FHIT played an important role in cervical tumorigenesis.MethodsBy incubating DNA in the presence of a methylase, we investigated the methylation of FHIT in four cervical cancer cell lines and one human umbilical vein endothelial cell line treating
4、 with the DNA methyltransferase inhibitor, 5aza2deoxycytidine(5azadC). The expression of FHIT was also monitored by RTPCR and immunofluorescence technique before and after 5azadC treatment.ResultsWe found that methylation of FHIT occured in the four cervical cancer cell lines instead of the ECV304.
5、Through RTPCR and immunofluorescence technique, we found that the expression of FHIT, which could hardly be detected in all four cervical cancer cells, was significant different after 5azadC treatment. However, the ECV304 cell expressed FHIT at constant levels before and after 5azadC treatment.Concl
6、usionWe concluded that hypermethylation of FHIT gene occurred frequently in cervical tumorigenesis. And hypermethylation within the regulatory 3sequences of FHIT gene might be an important means for its inactivation in cervical cancer.Key words：Fragile Histidine Triad Gene (FHIT); Human cervical can
7、cer cell lines; 5aza2deoxycytidine; DNA methylation; Immunofluorescence technique0 引言脆性组氨酸三联体( FHIT)基因是近年发现的第 1 个将染色体脆性位点和肿瘤相联系的候选抑癌基因，FHIT 蛋白表达下调的肿瘤细胞更具有恶性表型和恶性行为，因而它很可能是一种在多种肿瘤发生中起重要作用的肿瘤抑制基因，但它通过何种机制发生作用尚不清楚。研究发现 DNA5CpG 岛甲基化在基因表达、肿瘤发生过程中起重要作用1，但目前国内外对于甲基化引起 FHIT 基因失活及其与肿瘤发生的关系在宫颈癌方面的研究还很少，所以本文通过
8、研究在 DNA 甲基转移酶抑制剂 5氮脱氧胞苷 (5aza2deoxycytidine, 5azadC)的化学干预下 FHIT 基因在宫颈癌中的表达及其甲基化调控，以探讨 FHIT 在子宫颈癌发生中的作用及FHIT 基因失活的机制，以期进一步探讨宫颈癌的发病机制。1 材料与方法41.1 细胞系与培养 4 株宫颈癌细胞C33A、HeLa、CasKi、SiHa 及一株正常对照细胞人脐静脉血管内皮细胞 ECV304 均购自 ATCC（American type culture collection） 。CasKi 用含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 培养液，37，5 CO2 培养，其余细胞均
9、用含 10胎牛血清的高糖DMEM 培养液。1.25azadC 化学干预 5azadC 购自 Sigma 公司，干预时用培养基稀释为 0M，50-7M，10-6M，210-6M ，5 10-6M，10-5M 的工作浓度。接种对数生长期的细胞 2 10-5/60mm培养皿，培养 24 小时后以上述工作浓度的 5azadC 进行化学干预。再培养 24h 和 72h 后，收集细胞。1.3 基因组 DNA 的提取参照姜泊2 所著分子生物学常用实验方法提取高分子量细胞基因组 DNA，在紫外分光光度计上测定 DNA 浓度和纯度，OD260/OD280 的比值在 1.82.0 之间为合格。1.4 甲基化分析采
10、用甲基化酶温育法,用 10U 甲基化敏感酶Hpa将 1 g 基因组 DNA 37酶切过夜，以使其完全消化；同时用 10U 非甲基化敏感酶 Msp 完全消化基因组 DNA 为对照。然后5进行 PCR 扩增 FHIT 基因，引物序列及 PCR 反应条件参照文献3。若出现 FHIT 基因的扩增产物，则证实甲基化存在。1.5 逆转录聚合酶链式反应（ RTPCR）用 TRIZOL 试剂一步法提取细胞总 RNA，紫外分光光度仪检测纯度和浓度，取 2g 总RNA 用 MMLV 逆转录酶进行逆转录，PCR 扩增 FHIT 基因，并同时扩增 GAPDH 作内参照，引物由上海博亚生物公司合成；引物序列及 PCR
11、反应条件参照文献4。PCR 产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察、拍照。1.6 免疫荧光化学染色兔抗人 FHIT 多克隆一抗试剂购自北京中山生物技术公司。细胞培养 24h，再用上述工作浓度的5azadC 进行化学干预，培养 24h、48h 和 72h 后，取出细胞爬片，PBS 冲洗， 冷丙酮固定，1%Triton X100 室温作用 20 min，血清封闭，再分别加入兔抗人 FHIT 多克隆抗体，4过夜后，分别加入羊抗兔 FITCIgG，37温育后封片。实验同时设 PBS 代替一抗的阴性对照。1.7 统计学方法运用 SPSS11.5 统计软件包对实验数据进行统计学分析，采用 t 检
12、验。2 结果62.1 宫颈癌中 FHIT 基因甲基化分析 Hap 和 Msp 为同裂酶，两者都可以切开 CCGG 序列；而该序列甲基化为 CmCGG 时只有非甲基化敏感酶 Msp可切开，甲基化敏感酶 Hap的切割被阻断，由此差异可判断其甲基化情况。本实验结果显示 4 种宫颈癌细胞均存在 FHIT 基因的甲基化，因而未行去甲基化干预前以 Hap酶切及 PCR 扩增均可见不同程度的 FHIT 基因扩增产物，以5azadC 干预后再行 Hap酶切及 PCR 扩增则未见明显 FHIT 基因扩增产物，正常对照细胞 ECV304 在 5azadC 干预前后均未见明显 FHIT 基因扩增产物，差异有统计学意
13、义（P0.05） 。2.2RTPCR 检测 5azadC 化学干预前后各株细胞中 FHIT mRNA 的表达用 FHIT 与 GAPDH 的 IA 比值表示 FHIT 基因的表达水平，比值越大，FHIT 表达程度越高。CasKi 细胞IAFHIT/IAGAPDH 在不同浓度 5azadC 干预 24 h 后的值分别为0.170.03(0M)，0.450.04(510-7M)，0.890.08(10-6M)，0.840.03(2 106M)，0.750.09(510-6M)，0.640.03(10-5M),在 10-6M 及 2 10-6M 干预浓度下表达最强。干预 72 h 后FHIT mRN
14、A 表达与干预 24 h 的类似，但相对吸光度的值略低于后者；显示 5azadC 以 106M 及 210-6M 浓度干预 24 h 可诱导 FHIT 表达显著增强。其余株宫颈癌细胞所得结果与此类似。而 ECV304 细胞在干预前后均可见到较强 FHIT mRNA 表达，且7相对吸光度的值无明显差异，提示 5azadC 对宫颈癌细胞 FHIT基因的甲基化调控与正常对照组细胞相比较差异有统计学意义（P0.05） ，见图 1、2。M:100bp 的 DNA Marker1:5azadC 的浓度为0M2：5azadC 的浓度为 510-7M3：5azadC 的浓度为 10-6M4：5azadC 的浓
15、度为 210-6M5:5azadC 的浓度为510-6M6:5azadC 的浓度为 10-5M图 1 不同浓度的 5azadC 作用于 CasKi 细胞 24h 和 72h后的 FHIT mRNA 水平的变化（略）M:100bp 的 DNA Marker1:5azadC 的浓度为0M2：5azadC 的浓度为 510-7M3：5azadC 的浓度为 10-6M4：5azadC 的浓度为 210-6M5:5azadC 的浓度为510-6M6:5azadC 的浓度为 10-5M图 2 不同浓度的 5azadC 作用于 ECV304 细胞 24h 和72h 后的 FHIT mRNA 水平的变化（略）2.3 免疫荧光检测 5azadC 化学干预前后各株细胞中 FHIT的表达 5azadC 化学干预前 4 株宫颈癌细胞均未见明显 FHIT 的荧光着色，经过 5azadC 化学干预后，4 株细胞的胞浆中可见8FHIT 的表达强度明显增强，尤其在 10-6M 及 2106M 干预浓度下的表达最强；干预 48、72 h 后 FHIT 的表达与干预 24 h 的类似。ECV304 细胞在
