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1、1汉滩病毒西安分离 84FLi 的 M 片段全基因序列测定及分析作者：李新红杨为松杭长寿白雪帆马本江黄长形李光玉 【关键词】 汉滩病毒 关键词: 汉滩病毒;84FLi 株;序列分析; 系统发生树 摘 要: 目的 测定我国肾综合征出血热患者流产胎儿肝脏分离病毒 84FLi 株的全 M 片段基因序列，了解其分子基础. 方法 采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR） ，分节段扩增 M 基因片段的cDNA，直接用 PCR 产物或克隆入 pMD18-T 载体后进行测序. 结果 84FLi 株的全 M 基因序列组成为:M 片段基因共由 3616 个核苷酸组成，四种核苷酸的比例分别为A30.92%，C18.
2、03% ，G21.18% ，T29.87%.GC 含量为39.21%，AT 含量为 60.79%.最大开放读码框为 413448，共编码 1135 个氨基酸.核苷酸序列同源性分析表明 84FLi 株与 HTN 型同源性高于与其他型汉坦病毒的同源性，其中与中国株的同源性较高，与 HV114 株的同源性为 85.5%.与 HTNV 的国际标准毒株 76-118 的核苷酸同源性分别为 84.0%，氨基酸的同源性为 96.0%. 结论 84FLi 株属于汉滩型病毒，并与分离自国内的汉滩病毒同源性较高. 2Keywords:hantaan virus;strain84FLi;sequence analy
3、sis;phylogenetic tree Abstract:AIM To study the complete M segment sequence of84FLi，a Hantaan virus isolated from a fetal liver in Xian and to explore its molecular characters.METHODS The cDNA of M segment was amplified fragment by fragment us-ing RT-PCR.The purified PCR products were sequenced di-r
4、ectly or cloned into pMD18-T vector and then sequenced.RESULTS The complete M segment of84FLi strain was composed of3616nucleotides with a single open reading frame，extending from41to3448encoding1135amino acids.Homology analysis showed that the homology of84FLi M segment nucleotide sequences with HT
5、N isolates，especially Chinese isolates，was higher than that of other Hantavarises，for example，85.5%nucleotide sequences with HV114（iso-lated in China） ，while only84.0%with76118（HTN for-eign standard strain）.The amino acid homology between the two strains was96.0%.CONCLUSION The results sug-gest that
6、 Strain84FLi is one of the Hantaan virus，which is highly related to other 3Chinese Hantaan virus isolates. 0 引言 汉坦病毒（hantavirus ，HV）属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，人类感染可导致两种严重的疾病:肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syn-drome，HFRS）和汉坦病毒肺综合征（hantavirus pulmonary syndrome， HPS）. 病毒有包膜，其基因组是一个单链含大（L） 、中（M）和小（S）三个基因片段的负链
7、RNA，编码的结构蛋白分别为 L 蛋白（即依赖 RNA 的 RNA 多聚酶）、包膜糖蛋白（G1，G2）和核衣壳蛋白（NP） 1，2 .病毒的中和抗原位点、血凝抗原位点、型特异性位点和毒力位点等均位于包膜糖蛋白上，故测定 M 片段的核苷酸序列将有助于了解病毒致病性的分子基础3-5 ，同时 M 基因构建的系统发生树还可以用来做病毒分型.84FLi 株是杨为松等于 1984 年从肾综合征出血热患者流产胎儿的肝脏中分离的毒株6 ，经空斑减少中和试验和 M 片段部分基因序列分析鉴定为汉滩病毒型（hantaan virus，HTNV）7 .该毒株是中国预防医学科学院病毒学研究所研制的双价灭活疫苗（型）的生
8、产株，所制备的疫苗已被批准正式生产.测定该毒株的 M 片段基因组序列将有助于了解其分子基础，从而更进一步研究其生物学特性以及致病机制. 41 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 病毒株 汉滩病毒 84FLi 株系由杨为松等从胎儿脏器中分离，由病毒所保存. 1.1.2 引物设计及合成 参照汉滩病毒国际标准毒株 76-118的 M 片段核苷酸序列1 设计用于 PCR 扩增的引物（Tab1 ） ，由大连 TaKaRa 公司和上海 BioAsia 公司合成.P2 和 P3 由卫生部生物制品检定所姚智慧副研究员提供. 表 1 cDNA 合成及 PCR 扩增引物略 1.1.3 其他试剂 cDNA 合成试
9、剂盒及 ELON-GASE DNA 聚合酶购自 Gibco Brl 公司 . 1.2 方法 1.2.1 病毒 RNA 提取 病毒以常规接种 Vero 细胞.用 IFA 法检测细胞感染程度.待细胞荧光出现（75%100%细胞有感染病毒颗粒）时收获病毒，用于提取病毒 RNA.病毒感染细胞总 RNA 的提取按照 Gibco Brl 公司的 TRIZOL 试剂盒操作说明进行 . 51.2.2 cDNA 合成 以 PCR 扩增正向引物 S1 作为反转录引物，采用 Super scripTM 逆转录酶合成 cDNA 第一链. 1.2.3 PCR 扩增及克隆 以 cDNA 为模板，分节段扩增 M 基因片段.
10、PCR 产物于 10gL-1 琼脂糖凝胶上电泳分离，用QIAGEN 公司的快速凝胶提取试剂盒纯化. 纯化片段直接用于序列测定或克隆入 TaKaRa 公司的 pMD18-T 载体中 .克隆用 PCR 和酶切鉴定方法进行初步筛选. 1.2.4 核苷酸序列测定及分析 序列测定在 ABI PRISMTM377XL DNA 自动测序仪上进行，由大连 TaKaRa 公司和上海 BioAsia 公司完成.用 DNAstar 和 Clustlw 软件进行核苷酸序列和氨基酸序列的同 源性和系统发生分析. 2 结果 2.1 84FLi 株 M 片段核苷酸序列 84FLi 株 M 片段基因共由3616 个核苷酸组成
11、，四种核苷酸的比例分别为A30.92%，C18.03% ，G21.18% ，T29.87%.GC 含量为39.21%，AT 含量为 60.79%.最大开放读码框为 41-3448，共编码1135 个氨基酸.Mr 126500，等电点为 6.93.M 片段的全基因序列及其推导的编码氨基酸序列 GenBank 注册号为 AF345636.汉坦病6毒 M 基因具有布尼亚病毒科其他属共同的特征 :即在编码糖蛋白之前有一个先导序列，76-118 株的 M 基因 ORF 第 1 个 AUG 之后和成熟的 G1 氨基末端之前有一个 18 个氨基酸，构成典型的糖蛋白信号序列1 .84FLi 株也不例外，根据氨
12、基酸序列分析， 84FLi 株G1 起始于第 18 个氨基酸，从第 4042 位起始密码子 ATG 至8991 位 TGT 编码的 17 个氨基酸的短肽是典型的糖蛋白信号肽序列.G2 起始于第 649 位氨基酸，G1 与 G2 之间是一个由 5 个氨基酸残基（WAASA）组成的共翻译切割点，在细胞内质网内将前体大蛋白切割加工成 G1 和 G2 两个蛋白. 2.2 汉坦病毒 M 片段序列的同源性和差异性比较 应用 Jotun Hein 方法将 84FLi 株的 M 片段全基因序列与 GenBank 中的其他29 株汉坦病毒的 M 片段全基因序列进行同源性分析，84FLi 株与HTN 型同源性为
13、74.7%85.5%，其中与中国株的同源性较高，与A9 株的同源性为 85.4%，差异性为 16.6%.和其他不同型别汉坦病毒代表株 Seoul80-39，Thai749，Dobrava，CG1820，Bayou和 Moravia 的 M 片段的同源性分别为71.2%，70.4%，70.1%，58.0%，58.2% ，58.1%.M 片段氨基酸序列比较结果表明，与 HTN 型间同源性为 84.396.0%，与中国株 Z10 和 A9 株的同源性分别为 96.0%，95.3%.与 SEO 型的同源性为 72.8%76.4%.与其他型汉坦病毒氨基酸的同源性为53.8%76.8%，差异性为 38.2
14、%68.4%. 72.3 系统进化树分析 应用 Jotun Hein 方法进行种系发生分析，构建了 30 株汉坦病毒核苷酸和氨基酸的种系发生树（ Fig1）.从基于 M 片段核苷酸序列绘制的系统发生树来看， 84FLi 株属于HTN 型，与 A9、HV114 和 Z10 株等中国 HTN 毒株的亲源关系近于与韩国和日本的 HTN 毒株的关系.这与基于 M 片段氨基酸序列构建的系统发生树结果一致. 图 1 汉滩病素 84FLi 株 M 片段全基因序列的系统发生树略 3 讨论 汉坦病毒 84FLi 株分离自胎儿肝脏，是在 Vero 细胞上从 16株汉坦病毒中选育出的汉滩病毒疫苗候选株8 .具有适应
15、性好、繁殖力强、免疫原性好和抗原性好等优点.测定其 M 片段全基因序列，了解其分子基础及发病机制，将有助于防治汉坦病毒.梁米芳等应用交叉空斑减少中和试验（cross plaque re-duction neutralization test， cross-PRNT）对其抗原性的血清学分析以及用 M 片段 1984 至 2316 位间的 333bp 核苷酸区域序列系统发生树比较分析，结果表明:84FLi 株与 HTN 型毒株间同源性较高，属于HTN 型病毒7 .本研究测定了汉坦病毒疫苗株 84FLi 株的 M 片段的全基因序列，结果发现 M 片段由 3616 个核苷酸组成，四种核苷酸的比例分别为
16、 A30.92%，C18.03%， G21.18%，T29.87%.GC8含量为 39.21%，AT 含量为 60.79%.最大开放读码框为 41-3448，共编码 1135 个氨基酸. Xiao 等9 用系统进化分析法（phylogenetic anal-ysis）对 HV 进行了分型.由于两种病毒以共同的祖先分化的年代越久远，在他们的核酸分子中所积累的差异就越大，因而病毒核酸序列的相似程度能反映出病毒之间相似形和亲缘关系，进而可绘制出病毒的系统进化树，以此来比较 HV 的型别 10，11 .我们比较了包括 84FLi 株在内的 30 株汉坦病毒 M 片段核苷酸序列和氨基酸序列，在 DNAstar 软件上构建了汉坦病毒的系统发生树.序列同源性分析表明:84FLi 株与分离自国内的 HTNV 同源性较高.与 HTNV的国际标准毒株 76-118 的核苷酸同源性为 84.0%，氨基酸同源性分别为 96.0%.从
