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1、1比色法测定知母总皂苷含量【摘要】 目的建立测定知母提取物中甾体皂苷含量比色方法。 方法用茴香醛硫酸溶液做显色体系，测定波长 430nm，确定了最佳实验条件。结果标准曲线在 25150g 线性关系良好，相关系数0.999 8，平均回收率 98.2%(RSD=3.18%)。结论该方法稳定性和重复性较好，可用于知母提取物甾体皂苷类物质纯度检查。 【关键词】 知母； 比色法； 甾体皂苷； 茴香醛知母为百合科植物知母 Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根茎,性寒，味苦甘，具有清热泻火、生津润燥之功效，用于外感热病、高热烦渴、肺热燥咳、骨蒸潮热、内热消渴、肠燥便秘1 。知
2、母甾体皂苷是主要有效成分之一。药理研究表明，知母甾体皂苷具有“抗血小板聚集作用” 2 “上调脑 M2 受体及总 M 受体” 3 “对 受体调整作用” 4 “降低心率 ”“降血压” “对心肌缺血/复灌注损伤的保护作用” 5 “降血糖 ”6等作用。目前，测定知母总皂苷的方法主要有比色法。本文采用比色法，对不同显色体系进行了考察，测定知母皂苷提取物中的皂苷类物质含量，为知母提取物的质量控制研究提供参考依据。1 仪器与材料2TU-1901 双光束紫外可见分光光度计（北京通用） ，香草醛（3-甲氧基-4-羟基苯甲醛） 、茴香醛（对甲氧基苯甲醛） 、对二甲氨基苯甲醛、无水乙醇、甲醇、硫酸等均为 AR.级。
3、知母皂苷 A对照品（上海第二军医大学药学系提供，高效液相归一化方法测纯度为 97.2%） 知母药材提取物，共 9 个批号（060512， 060515， 060521，060622， 060728，060808，060816，060908，060928） ，本试验室自行提取分离。2 方法与结果2.1 对照品溶液精密称取知母皂苷 A 对照品适量,加甲醇溶解并制成每毫升约含 0.5 mg 的溶液，作为对照品溶液。2.2 供试样品溶液精密称取知母提取物粉末 100 mg，置 50 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成每毫升约含 2 mg 的溶液，作为供试品溶液。2.3 显色剂的选择为考察最佳
4、显色剂，参考文献报道7 ，考察了香草醛、茴香醛、对二甲氨基苯甲醛等显色剂的显色效果和稳定性，配制方法和用量分别为：3A：1%香草醛无水乙醇溶液 1 ml+硫酸-无水乙醇（710 ）1 ml；B：0.5% 茴香醛硫酸溶液 0.5 ml（ 0.1ml 茴香醛+1 ml 硫酸+18.9 ml 无水乙醇） ；C：0.35mol/L 对二甲氨基苯甲醛水溶液 1ml 0.08 mol/L盐酸乙醇 1 ml；方法：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各 100 l，置 10 ml 具塞试管中，挥干溶剂，取出，分别按上述方法加入不同的显色剂，振摇均匀后，置 100水浴中加热 5 min，取出，立即置冰水浴中放置 5
5、 min，各管精密加入无水甲醇 10 ml，摇匀，分别以各显色试剂同样操作管为空白，照分光光度法（中国药典2005 年版部附录A）进行扫描，测定最大吸收波长处的吸收度。每隔 5 min 测定一次，观察 30 min 内吸收度的稳定性。结果见表 1。表 1 几种显色剂的显色效果及稳定性（略）结果表明，香草醛为显色剂时稳定性较差，对二甲氨基苯甲醛不显色，故选择以茴香醛作为显色剂，并进一步考察各种因素对显色的影响。42.4 显色温度的影响精密吸取 8 份对照品溶液 100 l，至具塞试管中，挥干溶剂，取出，分别加 0.5%茴香醛硫酸溶液 0.5 ml,各取 2 份分别在 25，60，80和 100下
6、反应 15 min，取出，立即置冰水浴中放置 5 min，精密加入无水甲醇 10 ml，摇匀，分别以各温度下的试剂管为空白，测定最大吸收波长和吸光度。结果表明，反应温度对最大吸收波长无影响，均在 430 nm 和 504 nm波长处有最大吸收，但随着温度升高，430 nm 处吸收度下降，504 nm 处吸收度升高，而在 100条件下吸收度最高，较为灵敏，故选择反应温度为 100，测定波长 430 nm。2.5 显色时间的影响精密吸取 6 份对照品溶液 100 l，在反应温度 100 条件下，考察了反应时间 5，10，15 min 对吸收度的影响，以及吸收度的稳定性。结果见表 2。结果表明， 1
7、00反应 5 min 的吸收度较高，30 min 内的稳定性较好，故选择 100条件下，反应时间 5 min 为宜。表 2 反应时间对显色的影响及稳定性（略）2.6 线性范围考察分别精密吸取对照品溶液50，100，150，200，250，300 l，至具塞试管中，挥干溶剂，取出，分别加 0.5%茴香醛硫酸溶液 0.5 ml,在 100水浴中反应 5 min，取出，立即置冰水浴中放置 5 min，精密加入无水甲醇 10 ml，摇匀，以试剂管为空白，在 430 nm 波长处测定吸收度，以对照品加入量为横坐标，吸收度为纵坐标，计算回归方程。结果表明，5知母皂苷 A在 25150 g 范围内，呈线性关
8、系，回归方程Y 3.745 8X-0.037 7 (Y 为吸收度,X 为对照品毫克数 ) ，r0.999 8。2.7 精密度实验按 “2.6”项下方法，精密吸取对照品溶液0.5 ml，重复测定，计算 6 次测定结果的平均值和相对标准偏差，评估方法的重复性。结果表明，本方法的重复性较好，RSD 小于2.0%。2.8 含量测定精密称取知母提取物约 100 mg，置 50 ml 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取 100 l，按标准曲线方法测定，计算皂苷含量。结果见表 3。表 3 知母提取物含量测定结果（略）2.9 加样回收实验精密吸取含量测定项下样品溶液 50l，按含量测定方法处理，分
9、别加入对照品液 100l，测定吸收度，并以相同样品同样处理(不加对照品液)为对照。结果见表 4。表 4 加样回收率测定结果（略）3 讨论香草醛、茴香醛和二甲氨基苯甲醛都是鉴定皂苷常用的显色6试剂。考察结果表明，香草醛和茴香醛试剂(Anisaldehyde 试剂,即A 试剂 )均可用作测定知母皂苷的显色体系，但香草醛的稳定性不及茴香醛，而在以知母皂苷 A做对照时，不宜用盐酸二甲氨基苯甲醛试剂(Ehrlish 试剂,即 E 试剂) 作显色体系。这是因为，F 环闭环的单糖链皂苷和螺旋甾烷衍生皂苷只对 A 试剂显黄色,对 E 试剂不显色，而呋甾既可对 E 试剂显红色反应 ,也可对 A 试剂显黄色反应8
10、，9 。由于知母皂苷 A属于 F 环闭环螺甾皂苷，故不能用 E 试剂显色，但样品中因含有呋甾皂苷故呈现淡红色，但以知母皂苷 A做对照时，应选择 A 试剂作为总皂苷含量测定试剂。对比色条件优化结果显示，本试验最佳条件为 100反应 5 min,与文献报道7，8的 100反应 15 min 稍有不同，可能是皂苷种类不同，该法标准曲线在 25150 g 范围内线性关系良好,平均回收率为 98.2%(RSD=3.18%)，可用于测定知母提取物中皂苷物质纯度检查。该法所测定的吸收度随加热温度以及加热时间的改变而改变，因此测定时要在最佳比色条件下,严格按照操作步骤进行。对 9 批知母提取物测定结果表明，各
11、批次之间含量接近，说明本实验建立的分离提纯方法是稳定的。【参考文献】71中国药典委员会. 中国药典， 部S.北京:人民卫生出版社,2005：148. 2Zhang J,Meng Z,Zhang M,et al.Effect of six steroidal sapouius isloated from anemarrhence rhizoma on plactelet aggregation and hemolysis in human bolldJ.Clin Chim Acta，1999 ，289(1/2):79.3胡梅, 胡雅儿 ,张蔚，等. 知母活性成分 ZMS 对老年大鼠脑 M 受体的
12、调节作用J.中华核医学杂志， 2001,21(3):158.4赵树进, 韩丽萍 ,李俭洪知母皂苷及其苷元对动物模型 肾上腺素受体的调整作用J.中国医院药学杂志 ,2000,20(2):70.5邓云, 徐秋萍，刘振权，等 .知母皂苷化合物对脑缺血再灌注大鼠的保护作用J.北京中医药大学学报,2005,28(2):33.6李春梅, 高永林 ,李敏，等.知母皂苷对小鼠血糖的影响J. 中药药理与临床,2005,21(4):22.7李林洲, 余伯阳 .比色法测定短葶山麦冬药材中总皂苷含量J. 海峡药学,2005,17(3):44.88T Konishi,S Kiyosaw a, J Shoji.Studies on the Coloration Mechanism of Furostanol Derivatives with Ehrlich Reagent J.Chem Pharm Bull,1984,32(6):2111. 9T Konishi,S Kiyosaw a, J Shoji.Studies on the Coloration Mechanism of Furostanol Derivatives with Ehrlich ReagentJ .ChemPharmBull,1985,33(2):591.
