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1、1晶体-细胞的相互作用与肾结石关键字：肾结石 草酸钙(CaOx)是肾结石中最常见的晶体物质，它在生物体液中的溶解度非常低。所有人尿中的 CaOx 都经常处于过饱和状态，在特定的过饱和环境中可能自发产生 CaOx 沉淀。结石病人以及正常人的尿中常可查到 CaOx 结晶，而结石病人的 CaOx 颗粒较大。肾结石的形成是肾内一定大小的晶体潴留或粘附到肾小管上皮细胞上的最终结果1 。通常认为决定肾结石发展的主要因素是小管液中草酸盐的浓度，结晶调节因子的浓度和活性，以及肾脏内晶体潴留。越来越多的证据表明，肾小管上皮细胞积极参与了肾结石的病理生理过程，研究 CaOx 晶体与肾小管上皮细胞的相互作用对探讨尿
2、石症的发生机制有重要意义。 一、细胞模型的选择 目前已有适合使用的具有明确肾单位片段特征且能长期生长的细胞系。肾源性上皮细胞行组织培养时形成高度分化和有极性的单层细胞，顶部有微绒毛，并有连结复合体。在有渗透性的底物上培养的细胞比在硬塑料培养皿上的细胞分化程度高2 。根据研究机制选择某一特定的细胞模型，近曲小管细胞常用于研究草酸盐转运机制，因为草酸盐的转运仅发生于肾单位的这一部分。细支以远可见 CaOx 晶体，因此，研究晶体与上皮细胞之间的相互作用常选择具有远曲小管或集合管特征的肾细胞。LLC-PK1 和 OK-1 细胞分2别来源于 Hampshire 猪和美国负鼠，保留着许多近曲小管的特征，如
3、 Na+依赖的糖、氨基酸和磷酸转运功能3 。取自正常雄性矮脚长耳猎犬肾脏的 MDCK 细胞被广泛用作远曲小管或集合管的模型4 。两个独立的细胞系具有完全不同的特征，这证明了细胞系的异质性。用于肾结石研究的另一种肾上皮细胞是 BSC-1，它取自非洲绿猴，具体起源不清5 。也有用原代培养的大鼠肾髓质集合管细胞(IMCD)研究晶体- 细胞的相互作用。无论选择哪种模型系统，一般说来都要进行生理学方面的相关性研究，培养物在形态上和机能上应尽可能模拟体内的细胞模型。细胞系优于原代培养，前者在分裂繁殖过程中形成单层，利于培养。细胞可冻存，将来可恢复培养，可用同一物质重复实验。 二、晶体粘附 扫描电镜和透射电
4、镜图像显示肾小管管腔表面吸附有晶体，细胞内也存在晶体6 。在高草酸尿症大鼠肾脏内发现比管腔直径小得多的 CaOx 晶体沉积物吸附在肾小管上皮上。所有人的尿中都可查到晶体，提示晶体尿并非都是病理状态。正常人的肾小管上皮细胞可更好地抵制晶体的粘附。细胞表面或晶体表面被功能性物质如 TH 蛋白 (THP)，肾钙素(NC)，葡胺聚糖(GAGs)以及骨桥蛋白(OPN)覆盖，从而得到保护。细胞表面糖缀合物结构和成分的变化可使细胞包被失去阻止晶体粘附的作用7 。一水草酸钙(COM) 在数秒内即可与细胞表面结合，结合量与 COM 浓度有密切关系，这种粘附作用可被聚阴离子肝素阻断。其它 GAGs 成分如硫酸软骨
5、素3A，硫酸软骨素 B，硫酸乙酰肝素和透明质酸也可阻断这种粘附作用，而硫酸软骨素 C 除外。另两种聚阴离子聚谷氨酸和聚天冬氨酸也有这一作用。尿中的 NC，枸橼酸以及 OPN 都可抑制晶体与细胞的结合，但 THP 没有这种作用。用这些物质预处理晶体可起阻断效果，而预处理细胞无效，提示这些物质是作用于晶体表面而起作用。抑制物对晶体结合的抑制遵循 Langmuir 吸附等温式，表明晶体上抑制物分子结合位点对二者之间的粘附至关重要。聚阴离子鱼精蛋白可迅速逆转晶体与细胞的粘附，这可解释 GAGs 可逆性调节细胞晶体相互作用的现象8 。 至于为什么晶体对细胞表面有亲和力，似乎不存在能与晶体结合的特异性细胞
6、表面分子。正常情况下肾小管内形成的晶体将随尿排出。在某些条件下，晶体可获得对细胞表面的高亲和力，此时晶体结合可由有吸引力的离子键或氢键介导，它必须克服快速流动的小管液产生的剪切力。这种结合的证据源于对晶体片层与 IMCD细胞表面磷脂片层的对比，提示晶体与质膜间的接触是基于互补分子的静电和氢键9， 10 。另一方面，COM 晶体的结合由细胞表面带负电荷的分子介导。聚阳离子可阻断 COM 晶体与 BSC-1 细胞的粘附。此外，用神经氨酸酶或肝素酶预处理的 BSC-1 和 MDCK细胞可抑制 COM 晶体的结合力，提示唾液酸残基和硫酸乙酰肝素是细胞表面与晶体结合的潜在受体6 。而且 COM 晶体与
7、MDCK细胞的结合似乎与 pH 或温度有关，并发现由钙螯合诱导的质膜顶部变形可促进晶体的结合4 。根据以往的研究结果推断，细胞损4伤或细胞损害修复后反应性增生可使上皮极性丧失，从而触发晶体潴留。质膜的分子结构改变，细胞表面及小管液内阴离子质和量的变化，以及环境因素如 pH 的变化在晶体结合中可能起重要作用11 。三、晶体内化 晶体一旦粘附到细胞表面，至少部分会被摄入细胞内，这代表一种保护性机制，以去除细胞表面潜在的晶体生长点。另一方面，晶体胞吞可作为膜转换的一个非特异性结果。一旦细胞内晶体刺激细胞增生，可暴露新的膜功能区以供晶体结合，成为晶体聚集或晶体生长的位点。此外，有丝分裂也可松弛细胞与基
8、底膜的粘附力，增加细胞脱落机会，从而暴露基底膜，成为尿晶体附着的位点，为结石形成奠定了基础12，13 。培养细胞的晶体胞吞作用受肾小管液中正常存在的复合物的影响，体内分子结构的变化可影响这一过程。进入细胞内晶体的命运目前尚不清楚。超微结构研究显示，进入 MDCK 细胞内的晶体于 72 小时后消失，提示细胞内存在清除内化晶体的调节机制4 。还不清楚晶体是被转运至基底部还是管腔内，含晶体的细胞是否从单层上清除掉，然后被新细胞取代。晶体可能在细胞内溶酶体的酸性环境作用下溶解14 。在高草酸尿症病人及用致高草酸尿制剂处理的动物中，其肾小管腔内及肾间质均发现 CaOx 结晶，提示管腔内晶体可能被转运至间
9、质区。给予大鼠诱石饮食 9 天时，肾小管腔内上皮旁有晶体聚积，部分生长过度。这一结果可解释大颗粒向间质移位，或许只有相对较小的晶体才被小管细胞内化15 。也有报道 COM 晶体可刺激间质细胞生长，可5以推测，这些细胞的过度生长可影响细胞外基质，后者反过来又刺激上皮细胞生长。 四、细胞对草酸盐晶体的应答 研究显示，草酸盐不但可为结石提供适宜的环境从而促进晶体形成，该离子本身也可影响肾小管上皮细胞，使组织易于滞留晶体。特发性 CaOx 肾结石病人肾脏分泌反映细胞损伤的酶增加，这种损伤可能由离子化的草酸盐引起16，17 。用各种致高草酸尿制剂处理大鼠也可使尿中肾酶增高。草酸盐对 LLC-PK1 细胞
10、的生存力及生长的影响表现为浓度依赖性的双重作用。Scheid 等8，19 研究了不同浓度草酸盐对 LLC-PK1 细胞的作用，发现游离草酸盐浓度为 140350mol/L 时，细胞增生明显，且有胞浆空泡形成及核固缩现象；当游离草酸盐浓度大于 350mol/L 时，细胞数目减少，核固缩细胞增多，提示低浓度草酸盐是肾小管上皮细胞的分裂素，而高浓度草酸盐有明显细胞毒性作用。草酸盐可刺激LLC-PK1 细胞的癌基因 c-myc 表达，用 c-myc 的反义寡核苷酸预处理细胞可阻断这一反应，证明草酸盐的促细胞分离效应是通过 c-myc 基因的表达而起作用。草酸盐可促进培养的肾小管上皮细胞分泌 OPN，在
11、 BSC-1 细胞系的培养基中加入 COM 晶体后，COM 迅速与培养基中的 OPN 结合，1 小时后培养基中 OPN 下降 46%，而24 小时后 OPN 净含量增加 18%20 。用 Northernblot 方法检测发现 BSC-1 细胞接触 COM 晶体 12 小时后， OPNmRNA 的扩增达峰值，而羟基磷灰石晶体和磷钙石晶体没有这种作用，提示6COM 是 OPN 表达的有效刺激物。 MDCK 细胞也有类似反应，这可能是细胞的一种自我保护机制，因 OPN 可阻断晶体与肾小管上皮细胞的结合，并有抑制晶体成核、生长和聚集成核的功能21 。草酸盐对细胞的毒性作用可能与自由基的产生有关，对这
12、些结果的解释非常复杂。不过，由于近曲小管内草酸盐的浓度仅615mol/L，远曲小管内草酸盐的浓度为 2050mol/L，至集合管处达到高峰。即使应用草酸盐负荷后，并未达到 1mmol/L。用集合管细胞进行更详细的研究，可以揭示细胞对草酸盐反应的生理意义22 。晶体是对细胞有害，还是在与晶体结合之前细胞就有某些损伤，这一问题尚无满意的答案。肾细胞接触 COM 晶体后，编码转录起动子的细胞外基质调节因子及生长因子的基因表达增加，推测这些基因的蛋白质产物可引起原发性或继发性高草酸尿症病人的肾脏发生间质纤维化17 。一些研究者报道， COM 晶体对培养的肾小管上皮细胞产生损害作用，而另外的研究者发现细
13、胞与相对较低浓度的晶体接触并不产生可见损伤。可能肾小管上皮细胞能处理一定量的晶体，或较小的晶体不产生损害效果12 。 对晶体-细胞相互作用的研究仍处于起步阶段，培养的肾小管上皮细胞为研究肾结石发生发展的细胞机制提供了合适的模型。细胞系的缺点是它不具有肾单位不同片段的全部功能，而是只保留部分特征。不同实验室的细胞系或不同的培养时间有时可表现出明显的异质性，可能是由于遗传漂变或对初始细胞系的细胞选择引起细7胞的特征发生了改变。实际上培养细胞的表面包被与在体情况不同，在体外进行晶体-细胞相互作用的研究中通常不用晶体抑制物，提示这些实验条件反映的是病理状态而不是正常状态下的情况。只有在自然环境条件下对形态和功能都类似于在体情况的细胞进行实验研究，才能获得与生理性相关的结果。
