正常与不同证候 H22 荷瘤小鼠肾上腺高表达的基因

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1、1正常与不同证候 H22 荷瘤小鼠肾上腺高表达的基因作者：潘志强 方肇勤 卢文丽 梁超 吴中华 刘小美 侯俐 张辉 卓少元 廖明娟 高必峰【摘要 】 目的：揭示正常与不同证候昆明种荷瘤小鼠肾上腺高表达的基因。方法：采用昆明种正常小鼠与腋下接种 H22 腹水瘤细胞的小鼠，取接种肿瘤后第 8 天（早期）邪毒壅盛证与气虚证、第 21 天（中期）阳气虚证、第 29 天（中晚期）气阴阳虚证荷瘤小鼠与正常对照组小鼠肾上腺，抽提 RNA、纯化及 Gene Chip Mouse Exon 1.0 ST Array 检测。结果：筛选到 402 条高表达的基因，其中有 1 个及以上组别芯片读数计算值大于 5 00

2、0 的有 88 条。这些基因主要参与代谢和基因表达的调控，部分参与化学合成、化学加工修饰、运输和信号转导，以及部分参与免疫、细胞周期和细胞凋亡、发育；另有许多基因功能未知。结论：这些在正常与疾病小鼠肾上腺内持续且稳定表达的基因，可能对于维持肾上腺的正常生理功能具有重要的生物学意义；鉴于气虚证荷瘤小鼠这些基因大多表达量低于正常小鼠和同期的邪毒壅盛证小鼠，反映出气虚证候的本质及特征；再次，4 个不同证候荷瘤小鼠肾上腺这些基因表达差异分别有集中的趋势，印证了中医学“同病异证”的理论及其本质，要求辨证论治。 2【关键词】 肾上腺；小鼠；基因表达；基因芯片；肿瘤Abstract Objective To

3、 reveal the character of high expression genes in adrenal gland of normal and H22 tumour mice about typical symptoms and signs. Methods By the quantitative four diagnosis and syndrome differentiation methods and GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array, we observed adrenal gland gene expression about poison

4、ous pathogenic factors syndrome and asthenia of qi syndrome on 8th day, asthenia of yang and qi syndrome on 21th day, asthenia of qi and yin and yang syndrome on 29th day with H22 tumour mice. Results 402 high expression genes were gained, and the computed value of 88 genes are more than 5 000. Thes

5、e genes participate in metabolism, gene expression and regulation, chemistry synthesis and processing and modify, transport, signal transduction, immunization, cell cycle, apoptosis, development,and some genes function are unknown. Conclusion Those genes are persistent and steady expression in norma

6、l and H22 tumour mice adrenal that could be important biology significance. Genes expressed down-regulate may be reflect the essence and feature of 3asthenia of qi syndrome. Otherwise, differentially expressed genes in adrenal gland have coherent tendency among four different symptoms and signs, whi

7、ch confirm the theory and essence about different symptoms and signs of the same disease, and it is essential to execute syndrome differentiation and treatment.Key Words Adrenal gland; Mouse; Gene expression; GeneChip; Tumour肾上腺是机体的重要内分泌组织，在维持内环境稳定、应激、机体防御、免疫调控及糖、脂肪、水与电解质代谢中发挥重要作用，并受下丘脑-垂体的精密调控。以往对肾

8、上腺的研究主要集中在以下几方面1，2：肾上腺皮质和髓质的功能；肾上腺激素的合成、分泌与代谢；肾上腺激素合成的酶，如 20，22-羟化酶，20，22-碳链裂解酶、3- 羟类固醇脱氢酶、21-羟化酶、17-羟化酶、11- 羟化酶等； 酶的有关调节因子3，如白细胞介素类；胰岛素样生长因子；转化生长因子；碱性成纤维生长因子；肿瘤坏死因子 ；集落刺激因子；干扰素等，所涉及的基因不多。最近，我们在 H22 荷瘤小鼠证候本质的研究中，采用 Gene Chip Mouse Exon 1.0 ST Array 检测了正常与不同证候荷瘤小鼠肾上腺基因的表达差异，观察到许多高表达的基因，推测这些基因在维持肾上腺4功

9、能方面具有重要的作用，而且可能与证候本质有关，鉴于这些基因以往大多在肾上腺的研究中涉及不多，特报道如下。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物 昆明种雄性小鼠 250 只，体重（251）g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，动物合格证号 SCXK（沪）：2003-0003。1.1.2 试剂 主要试剂有： Trizol（GIBCO BRC） 、RNeasy Mini Kit（QIAGEN） ，RNA Nano LabChip 及 Gene Chip Mouse Exon 1.0 ST Array 及其试剂盒（2006 年） 。1.1.3 芯片检测仪器 小鼠四诊工作站、标准化四诊检测与辨证

10、方法参见有关文献4；Agilent-bioanalizer 2100，以及 Affymetrix 的芯片杂交炉、芯片洗涤系统、芯片扫描仪等。1.2 方法1.2.1 实验分组及处理 随机取 60 只小鼠作正常对照，另 190 5只腋下接种 H22 肿瘤腹水癌细胞 0.2 mL（4107 个/mL） ，出瘤后淘汰 40 只出瘤不佳及畸形小鼠，余 150 只。取正常小鼠 20 只，及荷瘤小鼠 150 只，共计 170 只用于四诊计量检测和辨证，另 40 只正常对照小鼠不做四诊检测，常规饲养。1.2.2 四诊计量化检测方法与计量辨证方法 参见有关文献4。1.2.3 荷瘤小鼠分期与常见证候的确定 依据我

11、们以往的研究，分别于接种肿瘤后第 7 天（早期） 、第 20 天（中期） 、第 28 天（中晚期）进行全体小鼠四诊检测与辨证，并分别于检测后的次日，即接种肿瘤后第 8 天（早期） ，辨证并筛选出最为典型的邪毒壅盛、气虚证候小鼠各 16 只，第 21 天（中期） ，辨证并筛选出最为典型的阳气虚证候小鼠 16 只，第 29 天（中晚期） ，辨证并筛选出最为典型的气阴阳虚证候小鼠 16 只。1.2.4 不同证候荷瘤小鼠的处死与取材 分批、分别处死以上各证候和正常对照小鼠，取下丘脑、垂体、甲状腺、肾上腺、睾丸、胸腺、脾脏和肿瘤组织。1.2.5 组织 RNA 的提取与检测 以上共 5 组样本采用 Tri

12、zol 和 RNeasy Mini Kit 及其方法分离和纯化 RNA；采用 RNA Nano LabChip 和方法检测 RNA 的质量。61.2.6 芯片检测 采用 Affymetrix 的 GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array 及其试剂盒所建议的检测方法。依据检测结果和 Affymetrix 建议的方法，采用 iterPlier 法计算核心基因表达读数值。以上 RNA 质量和芯片检测委托上海生物芯片有限公司完成。1.2.7 各组小鼠肾上腺高表达基因的筛选 筛选出各组小鼠肾上腺芯片读数计算值均大于 3 000 的，4 个不同证候荷瘤小鼠组与正常组比值一致介于 0

13、.52 倍之间基因。1.2.8 基因功能的检索方法 文中的基因功能主要参考文献5 ，及其 NCBI 数据库中的 PubMed、OMIM 、OMIA 等进行检索。2 结 果在 16 661 个核心基因中，符合以上筛选条件的基因有 402 条，其中有 1 个及以上组别芯片读数计算值大于 5 000 的有 88 条。其特征为，正常和不同阶段荷瘤小鼠肾上腺表达量均很高，不同组别间的差异小，说明这类基因在正常与疾病小鼠肾上腺内持续且稳定表达，可能对于维持肾上腺的正常生理功能具有重要的生物学意7义。具体如下。2.1 肿瘤发生后不同证候具有下调趋势的基因正常组比 H22 荷瘤小鼠各阶段表达高的基因较少，肿瘤

14、发生后有不同程度的表达下降，其中，早期邪毒壅盛证的表达量略高于气虚证，提示其肾上腺的活跃程度强于后者。见表 1。这类基因主要参与化学合成和代谢过程。 Cyp11a1 属于细胞色素 P450 亚家族类，主要参与 C21 类固醇激素生物合成，类固醇和脂代谢，电子传递等过程，其中在类固醇激素生物合成第一步由胆固醇合成为孕烯醇酮过程中起关键作用，有研究表明人正常及病理皮肤也表达 Cyp11a1、 Cyp17、Cyp21a2 等6。Fth1 为铁蛋白重肽 1，在肝脏、脾脏中主要参与铁离子运输和稳态，免疫应答，负调控细胞增殖等。有研究报道 c-myc 可以抑制 Fth1 表达7。Tsc22d1 为 TSC

15、22 域家族成员 1，别名 Egr5，Tgfb1i4，发现在骨骼肌中有高表达，参与调控转录等。Dad1 为抗细胞死亡防卫因子 1，主要参与细胞凋亡，蛋白氨基酸 N 连接糖基化经天冬酰胺等过程。Fth1、Tsc22d1、Dad1 这 3 条基因在肾上腺组织的研究中未见报道，本研究各组小鼠肾上腺均为高表达，提示它们可能具有重要的生理学意义。82.2 荷瘤小鼠早期不同证候肾上腺具有上调趋势的基因肿瘤发生的早期，肾上腺原先一些高表达的基因，其表达量进一步增加，集中在邪毒壅盛证候荷瘤小鼠，同期的气虚证小鼠仅个别基因表达有增加趋势。这类基因大体可以分为以下几类：2.2.1 参与代谢过程的基因 这类基因以邪

16、毒壅盛证表达增加为主，见表 2。其中，Aldoa 为醛缩酶 A，主要参与果糖代谢，糖酵解等，在各组小鼠中表达量非常高，肾上腺糖代谢活跃。Psap 基因主要参与脂和鞘糖脂代谢8。Acly 基因为 ATP 柠檬酸裂合酶，主要参与柠檬酸和 ATP 分解代谢，辅酶 A 代谢。Serinc1 为丝氨酸整合因子 1，主要参与磷脂酰丝氨酸和鞘脂代谢。Pdha1 名为丙酮酸脱氢酶 1，主要参与乙酰辅酶 A 代谢，糖酵解 9。Psma2 为蛋白酶体亚基 型 2，主要参与泛素依赖蛋白分解代谢。Psmb4 为蛋白酶体亚基 型 4，主要参与泛素依赖蛋白分解代谢。Taldo1 为转酰酶 1，主要参与糖代谢。Soat1 为固醇酰基转移酶 1，主要参与脂代谢，类固醇代谢等。2.2.2 参与调控转录，信号转导等的基因。主要见于邪毒壅盛证，气虚证总体上反而有下调趋势。9Rps14 基因名为核糖体蛋白 S14，有 5 个外显子，主要参与核