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1、1核因子 B 在胰腺癌中的表达及与 VEGF 和 p53 表达的相关性【摘要 】 目的 探讨核因子 B (NFB,p65)在胰腺癌组织中的表达及其与 VEGF、p53 蛋白表达的相互关系。方法 电泳迁移率变动分析 (EMSA)测定 45 例胰腺癌及癌旁组织、8 例慢性胰腺炎和 9例正常胰腺组织中 NFB 的活性,Western 印迹法检测NFB、IB a 蛋白表达; 免疫组织化学法检测胰腺癌中VEGF、p53、p65 蛋白表达。结果 NFB 在肿瘤组织中被激活；NFB 在胰腺癌、旁组织、慢性胰腺炎、正常胰腺组织中阳性表达率分别为 71.0%、20.0%、12.5%、0(P0.05)，与淋巴结转
2、移和周围浸润有相关性(P0.05)；转移癌中 NFB 蛋白表达与 VEGF、p53 蛋白表达显著相关。结论 核因子 B 基因在胰腺癌中过度表达并与 VEGF、p53 一起参与胰腺癌的浸润、转移过程。 【关键词】 胰腺癌 核因子 B 抑制性 Ba 血管内皮生长因子 蛋白质 p530 引 言2最近研究发现，肿瘤细胞浸润转移能力的改变是通过核因子 B对其他因子的调节作用实现的，但具体的作用机制还不清楚。本文拟研究核因子 B 在胰腺癌组织中的表达与胰腺癌生物行为的关系以及核因子 B 表达与 VEGF、p53 表达的相关性，为肿瘤的基因治疗提供理论依据。1 材料和方法1.1 材料收集苏州大学第一附属医院
3、普通外科 2000 年 4 月2005 年 5月期间病理诊断均为导管腺癌的 45 例胰腺癌石蜡标本（临床资料完整）及其 45 例癌旁组织 (距癌灶边缘 1.52.0cm， 33 例呈/级不典型增生表现，4 例呈原位癌改变， 5 例有炎性变化，3例有癌细胞浸润)。其中男 25 例，女 20 例，年龄 3670 岁，中位数 55 岁；肿瘤直径4cm 者 21 例，4cm 者 24 例；高分化 13例, 中分化 14 例,低分化 18 例；根据 TNM 分期（1997 恶性肿瘤国际临床病期分类）标准：期 11 例、期 9 例、期 13 例、期 12 例；伴有区域或远处淋巴结转移和周围浸润者 30 例
4、，其中远处转移者 18 例（肝转移、腹膜和网膜种植等）无淋巴结转移和周围浸润者 15 例。8 例慢性胰腺炎和 9 例正常胰腺组织新鲜标本，取3自壶腹癌和胰腺内分泌肿瘤的病人。所有标本在术后立即放入-70冰箱备用，所有病人均为第一次手术,术前未经任何放化疗。1.2 主要试剂鼠抗人 p65 单抗、鼠抗人 IBa 多抗、鼠抗人 p53 单抗（突变型） 、鼠抗人 VEGF 单抗，免疫组化染色（SP）试剂盒均购自北京中山生物技术公司， 32ATP 标记的双链寡核苷酸探针：5、AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC33、TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG51.3 方法1.3.1 Weste
5、rnblot 分析 提取细胞核蛋白 1，采用 Lowry 法准确测定浓度。蛋白质样品上样量每泳道为 100g，用 10%聚丙烯酰胺凝胶分离，并转到 Hybond 硝酸纤维素膜上（美国 Bio Rad 公司） 。1.3.2 电泳迁移率变动分析 细胞核的制备、核提取液蛋白含量的测定和反应条件参考文献1。41.3.3 免疫组化 操作方法按照试剂盒进行， p53、VEGF、p65表达的判断按照文献方法2,3 。1.3.4 统计学方法 采用医学统计软件 SPSS10.0,2 检验, Spearman 相关分析。2 结果2.1 Western 检测 NFB、IBa 的表达 p65 在肿瘤组织的灰度值高于癌
6、旁组织，IBa 在肿瘤组织的灰度值低于癌旁组织， （正常胰腺和慢性胰腺炎组织偶见表达） ，说明肿瘤组织中 p65 激活，而 IBa 失活见图 1、表 1。1：肿瘤组织；2：肿瘤旁组织； 3：正常胰腺组织； 4：慢性胰腺炎组织图 1 Western 印迹分析 p65、IBa 的表达2.2 EMSA 检测 NFB 的活性胰腺癌组织中可见明显的条带,癌旁组织少量条带，慢性胰腺炎和正常胰腺组织未见条带，提示肿瘤组织 NFB 结合活性提高，5见图 2。2.3 免疫组化法检测 VEGF、p53 、p65 蛋白表达 p65 在肿瘤组织的检出率 71%(32/45),高于癌旁组织 20%(9/45） ，P0.
7、01；p53、VEGF 在胰腺癌组织中的阳性表达分别为57.8%（26/45） 、64.4%（29/45） ，分别高于癌旁组织，差异有统计学意义（P0.05)；但p65 蛋白在浸润转移组的表达率高于非浸润转移组（P0.01 ） ，远处转移组高于非远处转移组（P0.05） ，见表 1。表 1 胰腺癌的临床病理特征与 p65 蛋白表达2.5 胰腺癌组织 p65 蛋白表达与 VEGF、p53 蛋白表达的相关性分析 VEGF 在浸润转移组和远处淋巴结转移组的阳性表达率分别为670%（21/30）和 88.9%(16/18); p53 在浸润转移组和远处转移组的阳性表达率分别为 66.7%（20/30）
8、和 83.33%(15/18)。在浸润转移和远处淋巴结转移组中的 VEGF 阳性表达组中，VEGF 和 p53的阳性表达符合率为 61.9%（13/21）和 75.0%（12/16） 。30 例浸润和淋巴结转移组胰腺癌组织中，p65 阳性表达 27 例，VEGF 在这 27 例中阳性表达 19 例，两者符合率为 70.4%（19/27 ） 。但在17 例 p65 阳性表达的远处转移组中，VEGF 阳性表达 14 例，两者符合率为 82.4%（14/17） 。同样，在转移组和远处转移组中，p53和 p65 的表达符合率分别为 59.3%（16/27）和 82.4%（14/17 ） 。3 讨论核因
9、子 B（NFB 、p50/p65）是近年来发现的一种转录因子，其表达水平与某些肿瘤的浸润、粘附、转移行为密切相关。近年来发现，核因子 B 引起肿瘤细胞浸润、粘附、转移的原因是由于核因子 B 激活后导致许多粘附分子、血管生长因子、基质蛋白酶的瀑布样释放。我们发现 4,5，核因子 B 在肝癌中高表达，并且表达越高，转移率越高；细胞系研究揭示6，核因子 B 与肝癌转移的关系通过 MMP9 实现；前列腺癌和膀胱癌的研究中发现 7,8，核因子 B 与肿瘤转移的关系分别通过 MMP9 、VEGF 和 IL8实现；胰腺癌细胞系研究提示9，核因子 B 与胰腺癌细胞转移行为有关，VEGF、IL8 参与了这个过程
10、。7本研究发现，胰腺癌组织中 NFKB 被活化， p65 蛋白在癌组织表达明显增高，表明 NFB 激活在胰腺癌的发生发展中有重要作用。本研究还发现，p65 蛋白表达与胰腺癌的分化程度、临床分期、肿瘤大小无关，但与与肿瘤周围浸润和淋巴结转移有关：p65蛋白表达在浸润和淋巴结转移组高于非浸润和转移组，远处转移组高于非远处转移组，说明核因子 B 参与了胰腺癌的浸润转移过程。VEGF 是最重要的促进血管生成的因子。有研究发现10,11 ，胰腺癌细胞 VEGF 基因的表达受 NFB 基因调控，因为 NFB 激活或阻滞后，VEGF 表达和血管生成发生变化，肿瘤细胞的转移能力发生改变，肺癌细胞系的研究也得到
11、了相同的结果12。在本试验中，VEGF 在胰腺癌组织中高表达，且 VEGF 表达水平与胰腺癌淋巴结转移和远处转移有关，VEGF 基因表达的改变可能与上述机理有关。VEGF 受多种因素调节，近年来研究表明，野生型 p53 下调VEGF 表达，而突变型失去这种功能13，本研究中突变型 p53 蛋白在胰腺癌中高表达(57.8%)，且 p53、VEGF 有很高的阳性表达符合率，突变型 p53 蛋白可能参与 VEGF 表达的调控，从而间接参与胰腺癌血管生成。8NFB 和野生型 p53 基因表达是相互协调的14。在肿瘤组织中突变型 p53 废除了野生型 p53 的作用，当 NFB 激活后，野生型 p53
12、诱导细胞凋亡的作用丧失，对 NFB 的抑制作用丧失。在本研究中，NFB 表达增加可能与 p53 突变和野生型 p53 抑制作用下降有关。比较 NFB、p53 、VEGF 表达的相关性发现，在转移组或远处转移组中，NFB 表达与 p53、VEGF 表达的符合率在 80%左右，表明 NFB、p53、VEGF 表达是相互联系的，它们在胰腺癌的浸润转移过程中共同发挥了作用，因此 NFB 是胰腺癌基因治疗的靶点。【参考文献】 1 Diana V, Messadi Hai S. Activation of NFB signal pathways in keloid fibroblastsJ.Arch De
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