人教版选修一课题3《血红蛋白的提取和分离》ppt课件1

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1、 血红蛋白 本课题学习目标本课题学习目标 体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法 并了 解色谱法 电泳法等分离生物大分子的基本原理 1 1 主要概念 主要概念 凝胶色谱法 电泳法 缓冲溶液 它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用 2 2 主要原理 主要原理 凝胶色谱法分离蛋白质的原理 电泳法分离样品的原理 缓冲溶液的组成和作用机理 3 3 课题重点 课题重点 凝胶色谱法的原理和方法 4 4 课题难点 课题难点 样品的处理 色谱柱填料的处理和色谱柱的装填 1 凝胶色谱法 凝胶色谱法也称为分配色谱法 它是根 据分子量的大小分离蛋白质的方法之一 又 称分子筛层析 凝胶实际上是一些微小的多孔球

2、体 例 如 浮石 琼脂 琼脂糖 聚乙烯醇 聚丙 烯酰胺 葡聚糖凝胶等 一 基本概念及原理 原理 当不同的蛋白质通过凝胶时 相对分子质量较小相对分子质量较大 凝胶内部的通道 容易进入 无法进入凝胶 内部的通道 只能在凝胶外部移动 路程较长 移动速度较慢 路程较短 移动速度较快 相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离 4 4 凝胶色谱法凝胶色谱法分离蛋白质的原理和的原理和具体过程具体过程 凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示 二 缓冲溶液二 缓冲溶液 在一定范围内 能够抵制 对溶 液PH值的影响 维持PH 不变 1 1 作用作用 2 2 配制配制 通常由 溶解于水中配

3、制而成 调节缓冲剂 的就可以制得在 使用的缓冲液 3 3 提问 在本课题中使用的缓冲液是提问 在本课题中使用的缓冲液是 其目的是其目的是 利用缓冲液模拟细胞内的PH环境 保证 血红蛋白的正常结构和功能 便于观察 红色红色 和科 学研究 活性活性 磷酸缓冲液 外界的酸和碱 基本 1 2 种缓冲剂 使用比例 不同PH范围内 思考 说出人体血液中缓冲对 NaH2PO4 Na2HPO4 H2CO3 NaHCO3 三 三 电泳电泳 血红蛋白的分离鉴定方法血红蛋白的分离鉴定方法 1 1 概念 概念 带电粒子在 作用下发生 的过程 2 2 原理原理 许多重要的生物大分子 如多肽 核酸等都 具有 的基团 在一

4、定的PH下 这些基团会带 上 或 在电场的作用下 这些带电分子 会向着的 的电极移动 电泳利用 了待分离样品中各种分子 以及分子 本身的 的不同 使带电分子产生不同 的 从而实现样品中各种分子的分离 3 3 类型类型 琼脂糖凝胶电泳 聚丙稀酰胺凝胶电泳 电场迁移 可解离 正电负电 与其所带电荷相反 带电性质的差异 大小形状 迁移速度 最常用的电泳支持介质是聚丙烯酰胺和琼 脂糖凝胶 琼脂糖有一个相对较大的孔径 用 来分离大分子例如核酸 大蛋白和蛋白复合物 聚丙烯酰胺形成孔径较小的胶 适合于分离 大多数蛋白和小片段核酸 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE 在在电场电场电场电场的作用下 的作用下 这 这这

5、这些些带电带电带电带电分子分子会会向着向着 与与其所其所带电带电带电带电荷相反的荷相反的电电电电极极移移动动动动 琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图 电泳检测PCR结果 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 1 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 等因素 它所带静电荷的多少以及分子的大小 2 SDS能与各种蛋白质形成蛋白质 SDS复合物 SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电 荷量 因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别 使电 泳迁移率完全取决于 分子的大小 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS PAGE 琼脂糖凝胶电泳操作简单 电泳速度快 样品不需要事先 处理 电泳后区带易染色 样品极易洗

6、脱 便于定量测定 测定蛋白质的相对分子质量常用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小 而非 所带电荷的性质和分子的大小 形状 典例1 有关凝胶色谱法和电泳法的说法正确的是 A 它们都是分离蛋白质的重要方法 B 它们的原理相同 C 使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要 D 以上说法都正确 解题关键 解答本题的关键应明确以下两点 1 凝胶色谱法的原理 2 电泳法的原理 A 二 实验步骤 蛋白质的提取和分离一般分为四步 样品处理 粗分离 纯化 纯度鉴定 电泳 实验操作实验操作 样品处理 一 蛋白质提取和分离步骤 二 操作过程 红细胞的洗涤红细胞的洗涤 粗分离

7、血红蛋白的释放血红蛋白的释放 分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液 纯化 纯度鉴定 透析 去除样品中分子量较小的杂质 用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的 杂质 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 血血 液液 血浆血浆 水水 分分 其他物质 其他物质 血浆蛋白 血浆蛋白 无机盐 磷脂 葡萄糖等无机盐 磷脂 葡萄糖等 血细血细 胞胞 白细胞白细胞 血小板血小板 红细胞红细胞 最多 最多 血红蛋白血红蛋白 9090 两个两个 肽链 肽链 两个两个 一肽链一肽链 四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团 2 2 血液有哪些成分 血液有哪些成分 1 1 用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取DNADNA 用哺乳动物的红细胞 用哺

8、乳动物的红细胞 提取血红蛋白的原因是什么 提取血红蛋白的原因是什么 鸡的红细胞具有细胞核 含有鸡的红细胞具有细胞核 含有DNADNA 便于进行 便于进行DNADNA 的提取 人的红细胞无细胞核 结构简单 血红蛋的提取 人的红细胞无细胞核 结构简单 血红蛋 白含量丰富 便于提取血红蛋白 白含量丰富 便于提取血红蛋白 血红蛋白血红蛋白 血红蛋白血红蛋白 两个两个 肽链 肽链 两个两个 一肽链一肽链 四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团 每个肽链环绕一个亚铁血红素基团 此基团可携带一分子氧或一分子二 氧化碳 血红蛋白因含有血红素而 呈红色 血红蛋白的特点 血红蛋白的特点 采集得到血液 加入抗凝血剂柠檬酸

9、钠 1 样品的处理 1 红细胞的洗涤 A 洗涤目的 B 分离时采用 离心 用 洗 涤 重复洗涤 直至 C 能否用蒸馏水代替生理盐水 去除杂质血浆蛋白 以利于后续步骤的分离纯化 低速短时间五倍体积的生理盐水 三次 上清液不再呈现黄色 表明红细胞已洗涤干净 不能 生理盐水能保持红细胞的渗透压而不至于破裂 若红细胞 提前破裂 使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起 加大分离难度 初次离心后的结果3次洗涤后的结果 2 释放血红蛋白 思考 1 释放血红蛋白过程中 在洗涤好的红细胞加入了 哪些物质 2 为了加速释放过程 采取了什么措施 使用磁力搅拌器充分搅拌 目的分析 1 蒸馏水的作用是 2 加入甲苯的作用是

10、3 充分搅拌的目的是 使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂 磁力搅拌器 搅拌器转子 搅拌器正在工作 3 分离血红蛋白溶液 用滤纸过滤 除去 脂溶性沉淀层 于 分液漏斗中静置片 刻后 分出下层的 红色透明液体 甲苯层 无色透明 甲苯层 无色透明 白色薄层固体白色薄层固体 红色透明液体红色透明液体 杂质沉淀层 暗红色 杂质沉淀层 暗红色 试管中溶液层次试管中溶液层次 柜式离心机 2 粗分离 透析 去除分子量较小的杂质 1 用 方法进行粗分离 透析袋由半透膜制 成 常用 将透析袋放入 溶液中进行透析 2 透析的原理是 3 透析的目的是 透析 玻璃纸 肠衣 膀胱膜 透析袋能使小分

11、子自由进出 而将 大分子保留在袋内 去除样品中分子量较小的杂质 磷酸缓冲 透析过程动画演示透析过程动画演示 1 凝胶色谱柱的制作 取长40厘米 内径1 6厘米的玻璃管 两 端需用砂纸磨平 底塞的制作 打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网 再用100目尼龙纱包好 3 纯化 凝胶色谱 去除相对分子量 较大的杂质蛋白 凝胶色谱柱的制作 2 2 凝胶色谱柱的装填 凝胶色谱柱的装填 凝胶的选择 凝胶的选择 A 材料 交联葡聚糖凝胶 G 75 凝胶的前处理 凝胶的前处理 配置凝胶悬浮液 计算并称取一定 量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后 配成 凝胶悬浮液 凝胶色谱柱的装填方法 凝胶色谱柱的装填

12、方法 A 固定 将色谱柱装置固定在支架上 B 装填 将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱 内 装填时轻轻敲动色谱柱 使凝胶填装均匀 注意 1 凝胶装填时尽量紧密 以降低凝胶颗粒之间 的空隙 2 装填凝胶柱时不得有气泡存在 因为气 泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序 降低分离效果 教材P70 为什么凝胶的装填要紧密 均匀 如果装填不够紧密 均匀 就会在色谱柱内形 成无效的空隙 使本该进入凝胶内部的样品 分子从这些空隙中通过 搅乱洗脱液中蛋白 质的洗脱次序 影响分离的效果 装配好的凝胶柱 3 样品加入与洗脱 加样前 打开下端出口 使柱内凝 胶面上的 缓慢下 降到与 平齐 关闭出口 缓冲液 凝胶面 注意

13、注意 正确的加样操作是 1 不要触及并破坏凝胶面 2 贴壁加样 3 使吸管管口沿管壁环绕移动 加透析样品 调整缓冲液面 与凝胶面平齐 滴加透析样品 加到色谱柱的 样品渗入凝胶床 再调整缓冲液面洗脱 收集 待 接近色谱柱底 端时收集 顶端 样品完全进凝胶层 红色的蛋白质 色谱柱制作成功的标志 色谱柱制作成功的标志 红色区带均匀一致的移动红色区带均匀一致的移动 记记 4 纯度鉴定 电泳 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 垂直板电泳装置 2 稳流稳压电泳仪 3 微量进样器 可用微量移液器代替 5 装槽 点样 拔出梳子 将胶板固定在电泳槽上 凹板 一侧向内 在电泳槽中加入缓冲液 点样 6 电泳 7 剥胶

14、 染色及脱色 凝胶板剥离 电泳结束后 撬开玻璃板 将 凝胶板做好标记后放在大培养皿内 加染色液染 色 然后用脱色液脱色 8 结果 思考下面的问题 思考下面的问题 让血红蛋白处在稳定的pH范围内 维持结构和功能正常 1 1 在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液 在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液 处理的目的是什么 处理的目的是什么 2 2 与其他蛋白质相比 血红蛋白有什么特点 这一特点对你 与其他蛋白质相比 血红蛋白有什么特点 这一特点对你 进行血红蛋白的分离有什么启示 进行血红蛋白的分离有什么启示 血红蛋白是有色蛋白 因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜 色来判断什么时候应该收集洗

15、脱液 这使血红蛋白的分离过程 非常直观 大大简化了实验操作 3 3 你能描述血红蛋白分离的完整过程吗 你能描述血红蛋白分离的完整过程吗 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步 包括 样品处理 样品处理 粗分离 纯化和纯度鉴定粗分离 纯化和纯度鉴定 首先通过洗涤红细胞 血红蛋白的 释放 分离血红蛋白溶液 离心 等操作收集到血红蛋白溶液 即 样品的处理 再经过透析去除分子量较小的杂质 即样品 的粗分离 然后通过凝胶色谱法通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋 白除去 即 样品的纯化 最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度 鉴定 典例2 2011 扬州高二检测 如图表示血红蛋白提取和分

16、离的部分实验装置 请回答下列问题 1 血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分 其 在红细胞中的作用体现了蛋白质具有 功能 2 甲装置中 B是血红蛋白溶液 则A是 乙装 置中 C溶液的作用是 3 甲装置用于 目的是 用乙装置分离蛋白质 的方法叫 是根据 分离蛋白 质的有效方法 4 用乙装置分离血红蛋白时 待 时 用试管收集流出液 每5 mL收集一管 连续收集 运输 磷酸缓冲液 洗脱血红蛋白 透析 粗分离 去除样品中相对分子质量较小的杂质 凝胶色谱法相对分子质量的大小 红色的蛋白质接近色谱柱底端 观察你处理的血液样品离心后是否分层 见教科书图5 18 如果分层不明显 可能是洗涤次数少 未能除去血浆蛋白 的原因 此外 离心速度过高和时间过长 会使白细胞和淋巴 细胞一同沉淀 也得不到纯净的红细胞 影响后续血红蛋白的 提取纯度 三 实验结果分析与评价三 实验结果分析与评价 1 你是否完成了对血液样品的处理 你能描述处 理后的样品发生了哪些变化吗 2 你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生 你的色谱 柱装填得成功吗 你是如何判断的 由于凝胶是一种半透明的介质 因此可以在凝胶柱旁放一支 与凝胶柱垂